三尖栝楼的抗肿瘤活性成分
2019-03-08周咏梅张思访
周咏梅，汤 琤，张思访
(江苏卫生健康职业学院，南京 211800)
栝楼属(TrichosanthesL.)是葫芦科(Cucurbitaceae)中一个重要的属，全世界约80种，广泛分布于亚洲东部及东南部。近年来，国内外对栝楼属植物的化学成分研究较多，其主要成分包括萜及其苷类、黄酮及其苷类、甾体及其苷类、苯丙素、生物碱以及氨基酸等[1-2]。药理研究证实，栝楼属中包含的三萜类成分(主要是葫芦素类)具有良好的抗肿瘤活性[3-5]。三尖栝楼(TrichosanthestricuspidataL.)是栝楼属中常见的一个品种，主要分布于斯里兰卡、印度、尼泊尔等国，在我国主要分布于贵州安龙[6]。本课题组在从天然药物中寻找抗肿瘤成分的过程中，发现三尖栝楼根二氯甲烷提取部位具有良好的抗肿瘤活性。为进一步阐明三尖栝楼根的抗肿瘤药效物质基础，本研究采用活性导向分离手段，对其进行了系统的化学成分研究，共分离得到10个化合物(图1)，其中1个hexanorcucurbitane苷类新化合物：khekadaengoside O(1)，以及9个已知化合物，分别为：khekadaengoside C-E,K(2～5),cucurbitacin J-2-O-β-glucopyranoside(6)，cucurbitacin K-2-O-β-glucopyranoside(7)，葫芦素 B,J,K(8～10)。另外，利用人肝癌细胞BEL-7402对分离得到的化合物1～10进行体外抗肿瘤活性评价。结果表明，化合物8～10具有显著的抗肿瘤活性。
Figure 1 Chemical structures of compounds 1-10
1 材 料
1.1 仪器和试剂
Ultrashield Plus 600核磁共振仪(德国布鲁克公司)；P-1020型旋光仪、FT/IR-480 Plus红外光谱仪(日本Jasco公司)；DU-7型紫外分光光度仪(美国贝克曼公司)；硅胶G(200～300目,青岛海洋化工有限公司)；6210型ESI/TOF质谱仪、1200高效液相色谱仪(DAD检测器，美国安捷伦公司)；ODS色谱柱(250 mm×19.0 mm,5 μm,Waters Atlantis T3 C18)；MPLC液相色谱仪[利穗科技(苏州)有限公司]；GF254制备薄层色谱板(烟台江友硅胶开发有限公司)。其他试剂均为市售分析纯。
1.2 药 材
三尖栝楼干燥根购自南京海源中药饮片有限公司，经江苏卫生健康职业学院张思访实验师鉴定为葫芦科栝楼属植物三尖栝楼(T.tricuspidataL.)的根，标本(No.20170506)存于江苏卫生健康职业学院药学院标本室。
2 方 法
2.1 提取与分离
取三尖栝楼干燥根5 kg，用甲醇回流提取3次(3×30 L)，每次2 h，过滤，合并滤液，浓缩至无醇味，浓缩液(0.5 L)加适量的水(2 L)使混悬，依次用二氯甲烷和正丁醇萃取(3×3 L,每次30 min)。细胞毒实验显示活性部位为二氯甲烷萃取部位，因此将二氯甲烷部位(30 g)经硅胶柱色谱(8 cm×50 cm,200～300目，1 kg)，以石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱 (10∶1 → 0∶1) 得到4个流份(Frs.A～D)。Fr.C(8 g)再经硅胶柱色谱(4 cm×50 cm,200～300目，0.4 kg)，以石油醚-乙酸乙酯(3∶1)洗脱，得到6个流份(Frs.C1～C6)。Frs.C2(1.1 g)再用制备TLC(氯仿-乙酸乙酯，5∶1)得到化合物8(17 mg)。Frs.C3(980 mg)再用制备TLC(氯仿-乙酸乙酯，4∶1)得到化合物9(38 mg)和10(53 mg)。Fr.D(12 g)再经硅胶柱色谱(4 cm × 60 cm,200～300目，0.6 kg)，以二氯甲烷-丙酮(20∶1 → 1∶1)梯度洗脱，得到4个流份(Frs.D1～D4)。Fr.D2(3 g)进一步用MPLC(甲醇-水，10∶90 → 90∶10)得到6个流份(Frs.D2-1～D2-6)。Fr.D2-2(560 mg)经制备HPLC(乙腈-水，42∶58)分离得到化合物1(24 mg)和化合物2(22 mg)。Fr.D2-3(430 mg)经制备HPLC(乙腈-水，35∶65)分离得到化合物5(68 mg)。Fr.D3(3.5 g)用制备HPLC(乙腈-水，30∶70→60∶40分离分离得到化合物3(39 mg)和化合物4(28 mg)；Fr.D4(2 g)用制备HPLC(乙腈-水，45∶55)分离得到化合物6(21 mg)和7(37 mg)。
2.2 化合物1酶水解[7]
将化合物1(5 mg)溶于甲醇0.5 mL中，加入质量浓度为5 mg/mL的橙皮苷酶水溶液20 mL，37 ℃水浴搅拌2 d。接着反应液用乙酸乙酯萃取并减压浓缩至干，得到化合物1a(3.8 mg)。通过与文献[8]的NMR及其他物理和光谱数据比较，确定化合物1a为hexanorcucurbitacin I。
2.3 MTT实验
人肝癌细胞BEL-7402与不同浓度化合物1～10在37 ℃条件下共培养72 h。根据文献[9]方法通过MTT实验对细胞增殖进行测定，每组均平行测定3次，顺铂作为阳性对照。
3 结果和讨论
3.1 结构鉴定
Figure 2 Significant HMBC correlations of compound 1
Table 1 1H NMR(600 MHz) and 13C NMR(150 MHz) spectral data of compound 1 in CD3OD
化合物8白色结晶(氯仿)，mp：180～182 ℃，ESI-MSm/z:557.3[M-H]-。1H NMR(CDCl3,600 MHz)δ：1.24(1H,m,H-1a),2.34(1H,m,H-1b),4.44(1H,m,H-2),5.82(1H,m,H-6),1.98(1H,m,H-7a),2.44(1H,m,H-7b),1.99(1H,d,J=8.7 Hz,H-8),2.78(1H,d,J=12.8 Hz,H-10),2.68(1H,d,J=14.8 Hz,H-12a),3.25(1H,d,J=14.8 Hz,H-12b),1.42(1H,m,H-15a),1.89(1H,m,H-15b),4.39(1H,m,H-16)，2.52(1H,d,J=7.2 Hz,H-17),1.00(3H,s,18-CH3),1.09(3H,s,19-CH3),1.46(3H,s,21-CH3),6.52(1H,d,J=16.0 Hz,H-23),7.08(1H,d,J=16.0 Hz,H-24),1.57(3H,s,26-CH3),1.58(3H,s,27-CH3),1.34(3H,s,28-CH3),1.31(3H,s,29-CH3),1.39(3H,s,30-CH3),2.00(3H,s,32-CH3)。13C NMR(CDCl3,150 MHz)δ：35.9(C-1),71.7(C-2),212.8(C-3),49.9(C-4),140.2(C-5),120.2(C-6),23.9(C-7),42.3(C-8),48.1(C-9),33.6(C-10),211.8(C-11),48.6(C-12),50.6(C-13),48.0(C-14),45.1(C-15),71.4(C-16),58.2(C-17),19.6(C-18),19.8(C-19),78.3(C-20),23.6(C-21),202.3(C-22),120.4(C-23),151.7(C-24),79.1(C-25),26.0(C-26),26.2(C-27),21.3(C-28),29.2(C-29),18.9(C-30),169.8(C-31),21.6(C-32)
3.2 MTT实验
化合物1～10对人肝癌细胞BEL-7402的细胞毒活性结果见表2。
Table 2 Cytotoxic activities of compounds 1-10 isolated from T.tricuspidata against BEL-4702 cell lines
由表2表明，化合物8～10显示出很强的抑制人肝癌细胞BEL-7402增殖活性(IC50为3.3～8.6 μmol/L)，与阳性对照顺铂活性相近(IC50为1.8 μmol/L)。同时，化合物1～5显示轻度抗肿瘤活性(IC50为31.3～85.9 μmol/L)，化合物6和7的抗肿瘤活性很弱，IC50大于实验设定的最高浓度100 μmol/L。对上述初步活性结果分析发现，活性最强的3个化合物8～10均是葫芦素类三萜苷元，与文献报道一致[12]，而其他7个活性一般的化合物均是葫芦素三萜苷类，表明该类三萜化合物的苷元比其苷类抗肿瘤作用更强，深入的构效关系有待进一步研究。
