大黄蛰虫丸对脂多糖与肝星状细胞TLR4交联的影响*

刘旭东, 徐新杰, 赵壮志, 吕萍

广西中医药大学附属瑞康医院肝病科(广西南宁 530011)

内毒素主要来自肠道的革兰阴性杆菌，成分是其细胞壁上的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，内毒素血症与肝纤维化关系密切[1]。现有研究表明，LPS通过活化肝星状细胞Toll样受体4(Toll-like receptor 4，TLR4)通路，下调了转化生长因子-β(TGF-β)假受体骨成形蛋白-激活素膜结合阻断因子(BMP and the activin membrane-bound inhibitor，BAMBI，放大了TGF-β信号，促进了肝纤维化[2]。大黄蛰虫丸是祖国医学活血祛瘀的代表方药，中医认为肝纤维化主要病机是瘀血阻络，大黄蛰虫丸切合肝纤维化的病机，并且在中国中西医结合学会肝纤维化诊治指南中被推荐使用。2015年1月至2018年5月,为明确大黄蛰虫丸抗肝纤维化机制，是否能阻断LPS与TLR4的结合，我们设计了该实验。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康清洁级雄性，Wistar大鼠，250～300 g，动物合格证号SCXK(军)-2012-0010，购于第三军医大学实验动物中心。大鼠肝星状细胞系HSC-T6，购于上海中国科学院细胞库。

1.2 主要试剂和耗材 DMEM 培养基、M199培养基、胎牛血清、牛血清白蛋白(美国Gibco公司)；胰蛋白酶；青霉素-链霉素溶液、DAPI、抗荧光淬灭剂(碧云天公司)；PBS(北京中杉)；DMSO、一抗LPS(美国Amresco公司)；台盼蓝粉末(美国Sigma公司)；多聚甲醛、TritonX-100(上海生工)；山羊血清(美国Hyclone公司)；激光扫描共聚焦显微镜(德国Leica公司)、LPS/PE(博奥森公司 批号：bs-2351R-PE)。

1.3 方法

1.3.1 大鼠原代肝星状细胞的分离培养鉴定

1.3.1.1 分离方法 将大鼠以10%水合氯醛麻醉，常规消毒后打开腹腔，经门静脉插管并肝素化(1 000 U/只)后，连接滴液瓶，剪断下腔静脉放血，快速灌注500 mL D-Hanks液至肝脏变白，流出液清亮。分离肝脏至大培养皿中，继续灌注0.05%链酶蛋白酶液100 mL和0.025%胶原酶液100 mL，每分钟约60滴。收集灌注液于烧杯内，剪碎肝脏剔除肝包膜及大血管后，连同收集的酶液置于磁力搅拌器上，加入DNaseI(终浓度40 μg/mL)，调整至200 r/min，继续消化45 min，200目钢丝滤网过滤。

1.3.1.2 洗涤收集 室温条件下滤液离心低速离心(50g，3 min)1～2次，去除未消化完全的肝细胞，然后以1 200 r/min离心7 min，吸弃上清液，加入Hanks液，小心吹打使细胞充分离散悬浮，再按上述条件离心洗涤1～2次，直至上清液较澄清，弃上清液，得到沉淀的肝NPC，加20 mL的DMEM培养液充分吹散悬浮细胞。

1.3.1.3 分离纯化 将1份生理盐水加入9份的Percoll细胞分离原液，然后再稀释成30%和70% 2种浓度各10 mL。取7支5 mL的玻璃离心管，依次小心加入约1.5 mL 70%Percoll液(1.097 g/mL)、30%(1.045 g/mL)、和肝NPC悬液，低温离心(500g，4°)30 min。分别仔细吸取肝NPC悬液和30%Percoll液、30%Percoll液和70%Percoll液界面之间的细胞，上层为HSC细胞，下面的为枯否细胞。加Hanks液按上述条件再洗涤2遍，以含20%新生小牛血清的DMEM或M199培养液悬浮细胞。

1.3.1.4 活性的鉴定 活性检测采用台盼蓝染色法。细胞在325 nm波长紫外光的激发下自发绿色荧光。

1.3.2 原代HSC与HSC-T6细胞系培养传代

1.3.2.1 原代HSC培养传代 分离获得HSC细胞以1×104cells/cm2密度接种于含15%胎牛血清的DMEM培养液中贴壁培养。每隔2 d换去1/3的培养液，培养至7 d后，HSC细胞已基本融合，并开始明显分裂增殖成团簇状。细胞铺满底层时即可传代，用0.25%胰蛋白酶37℃消化3～5 min，小牛血清终止继续消化，收集细胞悬液，上述条件离心洗涤1～2次，以1×105cells/cm2的细胞密度接种于6孔培养板。贴壁培养12 h后，吸弃上清液，分别加入含20%药物血清或不含药物大鼠血清的M199培养液继续培养。

1.3.2.2 大鼠肝星状细胞系HSC-T6细胞培养 将细胞培养于含10%优质胎牛血清和1%青霉素-链霉素双抗的DMEM培养基中，2～3 d换液1次，细胞80% 融合度时传代，可按照1∶3传代比例进行，于37℃，5%CO2及饱和湿度培养箱中培养。

1.3.3 含药血清制备 根据《金匮要略》记载，大黄蛰虫丸的药物由熟大黄、土鳖虫(炒)、水蛭(制)、虻虫(去翅足，炒)、蛴螬(炒)、干漆(煅)、桃仁、苦杏仁(炒)、黄芩、地黄、白芍、甘草组成，其剂量比例为3∶0.3∶0.6∶0.45∶0.45∶0.3∶1.2∶1.2∶0.6∶0.3∶1.2∶0.9。将上述12味中药药物粉碎成粗粉，按照临床用药习惯，取500 mL水浸泡1 h后煎煮，先武火煮沸15 min，后改成文火煎煮，保持微沸状态30 min，共煎煮3次。合并后采用超声提取法，减压浓缩，冷冻干燥得到总提取物粉末。在使用时加生理盐水将上述材料调至412 g/L，成为大黄蛰虫丸提取液。正常Wistar大鼠10只，其中正常对照组与含药血清组各5只，正常对照组给予灌胃生理盐水0.8 mL；含药血清组给予大黄蛰虫丸提取液0.8 mL，每组持续灌胃7天，2次/d。各组大鼠于末次给药后1 h腹腔注射7%水合氯醛(0.5 mL/100 g)麻醉，腹主动脉采血。血样静置2 h以上，待血块收缩良好后，3 000 r/min，15 min分离血清，血清以55℃处理30 min，用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，置-20℃保存备用。

1.3.4 细胞造模分组 将原代HSC和HSC-T6细胞系各分为空白对照组、含药血清组、LPS处理组、含药血清和LPS共同处理组，每组3样本。其中空白对照组：细胞继续常规培养48 h；含药血清组：用含20%大黄蛰虫丸含药血清的培养液作用于细胞48 h；LPS处理组：细胞先常规培养44 h后再加入100 ng/mL LPS作用于细胞4 h；含药血清和LPS共同处理组：先加入含20%大黄蛰虫丸含药血清培养液作用于细胞44 h后再加入100 ng/mL LPS共同作用于细胞4 h。

1.3.5 免疫荧光染色 在培养板中将已爬好细胞的玻片用 PBS(0.01 mol/L)浸洗3次，3 min/次；用4%的多聚甲醛固定爬片15 min，浸洗玻片同前；在玻片上滴加0.5% TritonX-100室温打孔15 min，浸洗玻片同前；在玻片上滴加正常山羊血清，室温封闭60 min；吸水纸吸掉封闭液，不洗，每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗LPS并放入湿盒，4℃孵育过夜；取出湿盒，37℃复温30 min，PBS(0.01 mol/L)浸洗3次，3 min/次，吸水纸吸干爬片上多余液体后滴加LPS-PE，湿盒中37℃孵育30 min；从加LPS-PE起，后面所有步骤都尽量在暗处进行。复染核：滴加DAPI避光孵育15 min，对标本进行染核，PBS 5 min×4次洗去多余的DAPI；用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在激光扫描共聚焦显微镜下观察采集图像。免疫荧光图片采用ImageJ2x(Rawak Software Inc.,Stuttgart,Germany)计算ROI值。

1.3.6 激光共聚焦检测LPS与TLR4交联在肝星状细胞中荧光强度变化 每张玻片滴加正常山羊血清，温室封闭60 min，然后滴加足够量的一抗LPS，4℃孵育过夜，然后滴加LPS-PE，湿盒37℃孵育30 min，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在激光扫描共聚焦显微镜下观察采集图像。

2 结果

2.1 自发荧光观察肝星状细胞的纯度 分离7 d的HSC呈星状细胞，细胞变长，胞体较大，胞浆内折光颗粒减少，部分细胞融合成片状。在激发波长325 nm 荧光显微镜下呈蓝绿色荧光，纯度>85%。见图1。

图1 原代肝星状细胞(×100)

2.2 LPS与TLR4交联在星状细胞中荧光强度变化 原代HSC中空白对照组、含药血清组、LPS处理组、含药血清和LPS共同处理组的ROI值分别是：9.48±0.05、4.07±0.68、18.44±2.61、14.20±2.21；HSC-T6空白对照组、含药血清组、LPS处理组、含药血清和LPS共同处理组的ROI值分别是：6.75±1.99、4.63±2.97、18.40±1.01、9.35±2.14。与空白对照组比较，LPS处理组的荧光强度增强(P<0.001)；与LPS处理组比较，大黄蛰虫丸和LPS共同处理组的荧光强度减弱(P<0.05)。说明大黄蛰虫丸减少LPS与HSC TLR4结合。见图2、3，表1。

A:空白对照组；B:含药血清组；C:LPS处理组；D:含药血清组和LPS共同处理组

图2 LPS与TLR4交联后在HSC中荧光强度变化(×800)

A:空白对照组；B:含药血清组；C:LPS处理组；D:含药血清组和LPS共同处理组

图3 LPS与TLR4交联后在HSC-T6细胞中荧光强度变化(×800)

项目HSC ROI值HSC-T6 ROI值空白对照组9.48±0.056.75±1.99含药血清组4.07±0.684.63±2.97LPS处理组18.44±2.61∗18.40±1.01∗含药血清和LPS共同处理组14.20±2.21△9.35±2.14△△F值76.35247.835P值0.0000.000

*与空白对照组比较P<0.001；与LPS处理组比较△P<0.05，△△P<0.001

3 讨论

肠源性内毒血症对肝纤维化启动有重要作用，LPS 是革兰阴性杆菌细胞壁的主要成分。而肝星状细胞的活化是肝纤维化发生、发展的中心环节。肝星状细胞活化，使其转化为肌成纤维细胞，通过旁分泌与自分泌作用，使HSC增殖，合成大量胶原和蛋白多糖等细胞外基质，沉积于肝脏，肝纤维化逐渐形成。

在慢性肝病中，由于肠黏膜结构发生改变，比如紧密连接受损、细胞间隙变宽、血管阻塞促使屏障功能丧失，导致肠道细菌释放的内毒素进入肝脏，通过肠肝循环，使肝脏不断暴露于肠道来源的内毒素，肝脏对内毒素的清除不足，形成肠源性内毒素血症[3]。Toll样受体(TLR)作为天然免疫系统重要部分，是识别微生物(细菌、病毒等)的模式受体[4]。TLR4主要是LPS的配体，主要表达于肝细胞、枯否细胞、星状细胞[4]。正常枯否细胞不表达TLR4，受到LPS刺激的枯否细胞表达TLR4增多。LPS与TLR4交联，激活枯否细胞使其合成并释放转化生长因子、血小板衍生生长因子、肿瘤坏死因子、干扰素等多种细胞因子，诱导HSC转化为肌成纤维母细胞，细胞外基质沉积增加，促进肝纤维化形成[5]。肝细胞表面低表达TLR4 mRNA和蛋白，在LPS刺激下，肝细胞表达TLR4增加，肝细胞通过产生LPS结合蛋白来增强肝非实质细胞对LPS的反应[6]。枯否细胞和肝细胞都是间接刺激肝星状细胞，从而促进肝纤维化。而肝星状细胞是发生肝纤维化的直接细胞、活化肝纤维化的中心环节。目前已经发现[3]，LPS是TLR4的外源性配体，通过肝星状细胞TLR4受体活化HSC，促进核转录因子NF-κB活化，下调了星状细胞TGF-β假受体BAMBI的表达，使HSC对TGF-β的刺激更加敏感，而促使纤维化发生。临床上慢性肝病患者常伴随肠道菌群移位，产生肠源性内毒素血症，导致血中LPS增加[7]。我们前期实验[8]发现大黄蛰虫丸可明显减轻大鼠肝纤维化，并降低血清中内毒素水平。LPS与HSC表面TLR4交联活化TLR4通路促进慢性肝病向肝硬化进展，因此阻断LPS与TLR4交联对于控制病情进展或逆转病情有重要作用。

大黄蛰虫丸[9]出自汉代医家张仲景的《金匮要略》：“五劳虚极羸瘦，腹满不能饮食，食伤、忧伤、饮伤、房室伤，经络营卫气伤，内有干血，肌肤甲错，两目黯黑。缓中补虚，大黄蛰虫丸主之。”其药物由熟大黄、土鳖虫(炒)、水蛭(制)、虻虫(去翅足，炒)、蛴螬(炒)、干漆(煅)、桃仁、苦杏仁(炒)、黄芩、地黄、白芍、甘草组成。诸药合用活血祛瘀、益气养阴、清热祛湿、泻下通腑，达到攻补兼施、扶正不留瘀、祛瘀不伤正的作用。大黄蛰虫丸是中国中西医结合学会肝病专业委员会制定的“肝纤维化中西医结合诊疗指南”推荐的防治肝纤维化的中成药。大量的临床研究结果表示[10-11]，大黄蛰虫丸联合核苷酸类似物治疗慢性乙型肝炎不仅改善HA 、LN、PCⅢ等纤维化指标，也在改善ALT方面优于单用核苷酸类似物，目前大黄蛰虫丸在临床上广泛应用于肝纤维化的治疗。

本实验研究表明LPS处理组的荧光强度强于正常组，表明肝纤维化模型中LPS与TLR4交联增强；大黄蛰虫丸与LPS共同处理组的荧光强度明显弱于LPS处理组，表明这可能是大黄蛰虫丸能阻断LPS与TLR4的交联。这可能是大黄蛰虫丸抗肝纤维化机制之一。