联合检测CK19、BRAF及FAK在甲状腺乳头状癌中的诊断价值

史国恩，包万智，李轶春，陈晓明，蔡汉章，潘能武

广西北海市中医医院普外科,广西北海 536000

甲状腺乳头状癌起源于滤泡上皮细胞，是一种分化良好的恶性肿瘤，占原发性甲状腺恶性肿瘤的55%～65%，可发生在任何年龄，多见于40岁以下，男女比例为1∶(2～4)。5年生存率为73%～93%，10年生存率为60%～83%[1]。据统计近年来甲状腺癌发病率呈上升趋势。随着免疫组化的发展，早期诊断和及时治疗是提高甲状腺乳头状癌生存率的关键。细胞角蛋白19(CK19)的联合检测BRAF基因表达、粘着斑激酶(FAK)、CK19、BRAF 和 FAK 均在甲状腺乳头状癌[2]中高表达，提示CK19、FAK和BRAF的表达可能与肿瘤的发生有关。该文收集了该院2013年1月—2018年1月收治的60例甲状腺乳头状癌的存档蜡块，以分析细胞角蛋白19(CK19)、BRAF基因表达、粘着斑激酶(FAK)在甲状腺癌中的表达，探讨CK19、BRAF和FAK在甲状腺乳头状癌诊断中的作用，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取在该院治疗的甲状腺乳头状癌60例。其中男13例，女47例，年龄最小23岁。最大年龄为73岁，平均年龄为(48.5±6.7)岁；所有标本均经术后病理诊断为乳头状甲状腺癌，甲状腺乳头状癌患者术前未接受放疗或化疗。研究所选病例已经过伦理委员会批准，患者或其家属对该研究知情同意。

1.2 方法

1.2.1 应用试剂 鼠抗人CK19单克隆抗体，浓缩型鼠抗人FAK单克隆抗体和Envision检测试剂盒，聚合酶链式反应试剂和基因组DNA抽提试剂盒[3]。

1.2.2 操作方法 ①免疫组化法检测 CK19、FAK、BRAF蛋白表达，使用Envision两步法，将阳性切片作为对照品，将PBS作为阴性对照。每个切片选择5次四百次视野，计数阳性细胞百分率和着色度计分，根据视野内阳性细胞所占比记录阳性细胞百分比，包括无着色为 0分，＜25%记作1分，26%～50%记作2分，51%～75%记作3分，＞75%记作4分[4]。根据阳性细胞着色特征将其记录为无着色记作0分，淡黄色记作1分，棕黄色记作2分，棕褐色记作3分，将上述结果相加，0分为阴性，2～3分为弱阳性，4～5分为中等阳性，6～7分为强阳性。②聚合酶链反应和DNA测序检测BRAF突变，根据DNA提取试剂盒的说明书从组织标本中提取DNA，然后用上游引物和下游引物扩增DNA。利用琼脂糖凝胶电泳证实产物可靠性，之后将产物进行DNA测序，将结果与DNA序列进行比较，明确其突变情况[5]。观察CK19、BRAF和FAK蛋白在乳头状癌组织中的表达，比较CK19、BRAF和FAK蛋白标志物的敏感性和特异性，以及与临床病理参数肿块大小、淋巴结侵袭、局部复发的相关性。

1.3 统计方法

采用SPSS 20.0统计软件对所有患者的资料进行分析处理，计数资料采用%表示，进行χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CK19、FAK、BRAF 蛋白表达

CK19表达部位在细胞膜和细胞质当中，患者阳性表达率为100.00%；FAK在细胞核或细胞质中呈棕黄色颗粒阳性，少数核染色，患者阳性表达率为73.50%，主要表现为中等及以上强度；BRAF蛋白表达部位在细胞膜，部分观察到腺腔边缘着色，患者阳性表达率为63.33%，主要表现为中等及以上强度。CK19、FAK、BRAF蛋白表达在患者当中的表达情况见表1。

表1 该组患者CK19、FAK、BRAF蛋白表达

2.2 患者 CK19、CK19、FAK、BRAF蛋白表达与病理参数的关系

不同年龄、性别、肿瘤大小及淋巴结转移情况CK19、FAK、BRAF蛋白表达均差异无统计学意义（P＞0.05），见表 2。

表2 患者CK19、FAK、BRAF蛋白表达与病理参数的关系

CK19(+)特异性和敏感性在甲状腺乳头状癌中分别为49.90%和100.00%；FAK(+)特异度和灵敏度分别为73.50%和96.50%；BRAF(+)的特异性和敏感性分别为 63.30%和 97.70%；BRAF(+)联合 FAK(+)的特异性和敏感性分别为97.30%和95.30%；BRAF(+)与CK19(+)联合的特异性和敏感性分别为95.80%和94.60%。CK19(+)与FAK(+)灵敏度分别为92.90%和94.70%；CK19(+)联合 BRAF(+)、FAK(+)特异度和灵敏度分别为94.20%和98.80%；CK19联合其他指标表达比较可以看出，BRAF、CK19或者FAK同时表达对甲状腺乳头状癌诊断鉴别的特异度和灵敏度最高。

2.3 患者BRAF基因突变情况分析

按照BRAF基因突变测序结果可以看出，该组38例外显子15突变1 799例，属于杂合突变，突变率为63.33%。BRAF基因突变在不同年龄段、性别、肿瘤大小和淋巴结转移当中差异无统计学意义（P＞0.05）。

3 讨论

甲状腺癌是内分泌系统常见的恶性肿瘤，甲状腺乳头状癌约占80%；全球甲状腺癌发病率为1%～2%[6]，中国甲状腺癌的年发病率为0.5～40人/100 000。虽然绝大多数甲状腺癌可以通过手术和药物治疗治愈，但10%～20%的患者仍然死于肿瘤的低分化和进展。近年来中国甲状腺癌发病率逐年上升，尤其是女性，对人类健康有害。甲状腺癌的具体病因尚不清楚，但多年的临床和流行病学研究发现，放疗、激素效应、碘摄入量等与甲状腺癌的发生有关。

CK19为I型CK，分子量为40 KD；其主要表达于单层上皮细胞，分布于扁平鳞状上皮基底细胞。国内外许多研究者[7-10]已发现CK19在乳腺癌、甲状腺乳头状癌、大肠癌、膀胱癌、肺鳞癌等多种肿瘤组织中的表达。近年来国内学者对低分子量角蛋白CK19在甲状腺病变中的表达进行了研究，发现其在甲状腺乳头状癌组织中呈强而弥漫的表达，而在正常甲状腺组织、甲状腺腺瘤、结节性甲状腺肿或局灶性表达中则不表达，推测CK19可能参与甲状腺乳头癌的发生和发展与肿瘤的转移有关。

BRAF位于7q34，能有效地作用于MAPK信号通路，BRAF基因突变发生在甲状腺癌患者中，常见突变点为第15外显子1799位点；此次研究结果显示38例BRAF突变，突变率为63.33%，并且与不同年龄、性别、肿瘤大小和淋巴结转移无显著差异。

FAK是一种非受体酪氨酸激酶，它与酪氨酸激酶2和细胞黏附激酶β形成FAK家族，FAK抑制细胞凋亡，FAK是一个依赖于锚的生存信号，当FAK表达在肿瘤细胞中被抑制时，可引起细胞凋亡。FAK的高表达可增强细胞外信号的存活，抑制肿瘤细胞失去粘附后的失巢凋亡，促进肿瘤细胞的增殖和迁移。此次研究结果表明，FAK在甲状腺乳头状癌中呈阳性表达，FAK的高表达增加了甲状腺乳头状癌的细胞外存活信号，FAK在肿瘤的发生、发展、侵袭和转移中起重要作用。

该次研究结果显示甲状腺乳头状癌患者的CK19阳性表达率为100.00%，FAK阳性表达率为73.5%，BRAF突变率为 63.33%，张芳等[11]在 CD56、CK19及BRAF诊断甲状腺乳头状癌的研究中得出30例甲状腺乳头状癌患者中CK19阳性表达例数为29例，阳性表达率为96.70%，BRAF突变率为63.33%，与该次研究结果相近，而高玉宝等[12]在研究中得出FAK在甲状腺乳头状癌组织中的阳性表达率为75.00%，与该次研究结果相近。可见CK19、FAK阳性表达和BRAF突变与甲状腺乳头状癌的发生存在密切关系。

4 结语

CK19、FAK和BRAF联合检测对甲状腺乳头状癌的敏感性、特异性分别为94.60%和98.80%，高于单抗体或其他两种组合。综上所述在诊断甲状腺乳头状癌患者时，联合检测CK19、FAK、BRAF表达的病理价值比较高，并且BRAF突变时导致患者出现甲状腺乳头状癌的重要指标，对甲状腺乳头状癌的临床确诊具有显著作用。