长链非编码RNA -AFAP1-AS1在神经胶质瘤中表达水平及影响预后的相关因素研究

于庆伟，秦彦昌，张百平，罗国强

空军军医大学第二附属医院神经外科(西安710038 )

胶质瘤是最常见的中枢神经系统肿瘤，其中70%属于高病理分级，患者术后复发率和病死率均很高[1]。尽管科研工作者一直致力于探索更有效的治疗方法，但由于肿瘤细胞的多样性和高侵袭力以及胶质瘤患者的异质性，胶质瘤目前仍然是人类最致命的癌症之一，胶质母细胞瘤患者中位生存期甚至只有12月[2-3]。影响胶质瘤患者的预后因素包括：卡氏行为状态评分 (KPS) 、组织学分级以及术后复发[4-5]。但目前已有研究表明，单独的标准可能不足以估计患者预后，因此需要探索一种生物标志物和治疗靶点，可进行早期诊断并且可以更准确的预测预后[4-5]。长链非编码RNA(lncRNAs)被广泛定义为长度大于200个核苷酸并且缺乏开放阅读框架的RNA分子[9-10]。目前，它已被发现涉及大脑的进化、发展和一些疾病过程，并可用作治疗和诊断的新的生物标志物和靶点[11]。之前有研究表明，通过筛选转录表达谱发现lncRNAs在胶质瘤组织的表达可发生显著改变[12]。此外, lncRNAs与胶质瘤的发展和调节细胞生长和转移的进展有关，表明lncRNAs在胶质瘤发生发展中起重要作用。例如研究者证实，过表达的DANCR可通过激活Wnt/β-catenin信号通路，促进胶质瘤的恶性进展[13]。还有实验显示lncRNA-ZEB1-AS1的下调可以抑制胶质瘤细胞的增殖、侵袭和迁移[14]。肌动蛋白丝相关蛋白1反义RNA1(AFAP1-AS1), 位于人的 4 号染色体肌动蛋白丝相关蛋白1(AFAP1)基因反义链上，是一个长度约6810 bp的一种长链非编码RNA，已经有相关研究显示AFAP1-AS1 的表达水平与消化系统肿瘤(胃癌、胆囊癌、食管癌、结直肠癌等)的发生发展和转移以及患者临床参数和预后都密切相关[15-18]。然而目前我们对lncRNA AFAP1-AS1在胶质瘤中的作用以及对患者预后的影响所知甚少。为了确定lncRNA AFAP1-AS1表达在胶质瘤中的临床意义, 我们分析了AFAP1-AS1表达与临床病理特征的关系, 包括与患者的生存率的关系。我们发现肿瘤组织中AFAP1-AS1表达水平高于正常脑组织。此外, lncRNA AFAP1-AS1的表达与胶质瘤患者的恶性状况和不良预后都密切相关。

对象与方法

1 研究对象 回顾性统计空军军医大学唐都医院神经外科2008年1月到2013年1月共70例脑胶质瘤手术切除术患者的临床资料。选择标准：①患者没有其他肿瘤病史；②具备完整的临床数据，包括：年龄、性别、平均肿瘤直径、肿瘤数量、病理分级、KPS评分、术后复发情况；③正常脑组织样本从同期入院进行颅脑内减压术治疗的患者中获得；④患者术前均未进行放、化疗治疗或其他抗癌治疗；⑤所有入选患者均签署知情同意书，自愿参与本研究；⑥获得本院伦理委员会批准。对参与的患者进行5年的随访, 随访方式为门诊复诊或进行电话随访，统计患者从最初的手术到死亡的日期计算了整体存活率，随访截止时间2018年1月。其中因意外事故或因与胶质瘤无关的情况而死亡的患者被排除。

2 研究方法 组织在切除后立即冻结, 储存在液氮中。采用Trizol 法 (Invitrogen, CA, USA)提取组织标本中的总RNA，然后用紫外分光光度计测定组织标本在波长为260 nm以及280 nm 处的吸光度比值OD 260/280，计算RNA浓度并评估纯度，RNA样品OD值在1.9～2.0范围内为合格。取 1 μl上述组织总RNA,按照逆转录试剂盒说明将 RNA 逆转录为cDNA,反应参数：37 ℃ 反应 15 min (反转录)，85 ℃ 反应 5 s。然后应用 RT-PCR法分别检测神经胶质瘤组织和正常脑组织标本中AFAP1-AS1的表达水平，内参基因设置为GAPDH。引物及探针序列如下：AFAP1-AS1上游引物正向: 5’-AGCCTTGGTGAGCAATAGGT-3’, 下游引物反向: 5’-GGTATGAAGGGTGTGGGTGA-3’, GAPDH上游引物正向: 5’-TGTTGCCATCAATGACCCCTT-3’,下游引物反向: 5’-CTCCACGACGTACTCAGCG-3’。然后采用2-ΔΔCt法对测得的数据进行相对定量分析，计算AFAP1-AS1在胶质瘤组织和正常脑组织的不同表达水平，所有实验均重复3次以上。

结果

1 神经胶质瘤组织中AFAP1-AS1表达水平 为了确定AFAP1-AS1在胶质瘤中的作用，我们应用RT-PCR检测其在组织中的表达情况(图1)。结果显示，与相邻脑正常组织相比, 胶质瘤组织表现出较高的表达水平[胶质瘤组织(2.881±0.273)、正常脑组织(1.000±0.313)，P=0.0007]。同时通过数据对比，AFAP1-AS1的表达水平随着胶质瘤恶性程度的增高而增高[WHO I～II级(2.250±0.288)、WHO III～IV级(3.512±0.294)，P=0.012]，说明AFAP1-AS1的表达水平与胶质瘤的恶性程度呈正相关。

图1 LncRNA-AFAP1-AS1在脑组织和肿瘤组织中的表达水平

2 AFAP1-AS1表达与胶质瘤临床病理指标的相关性 见表1。基于所有胶质瘤的中位表达水平，我们将胶质瘤组织标本分为低表达组(n=38)和高表达组(n=32)。结果显示：神经胶质瘤组织中高表达水平的AFAP1-AS1与高病理分级(P=0.029)、低KPS 评分(P=0.015)以及患者术后复发(P=0.021)有密切关系，而与患者的年龄(P=0.729)、性别(P=0.762)以及肿瘤大小(P=0.934)等均无关。

表1 LncRNA-AFAP1-AS1表达水平与胶质瘤患

3 AFAP1-AS1的表达水平与胶质瘤患者不良预后的关系 为了探讨AFAP1-AS1表达水平在胶质瘤患者中的预后价值, 利用 Kaplan-Meier分析并进行Log-rank试验, 分析AFAP1-AS1表达水平与患者生存率的关系(图2)。在70例胶质瘤患者中, 我们发现AFAP1-AS1表达与胶质瘤患者整体生存率成反比。换言之, AFAP1-AS1表达下降的患者总存活率优于AFAP1-AS1表达上升的患者。此外, 我们还发现, AFAP1-AS1的过度表达在胶质瘤患者中表现出明显不良的预后情况, 无论其等级、肿瘤大小和肿瘤位置如何。进一步研究AFAP1-AS1的表达是否是影响胶质瘤患者预后的独立因素，以及探索其他可能影响神经胶质瘤患者临床预后的因素。我们将各患者临床病理指标与生存率进行了单因素和多因素COX比例风险回归分析。分析结果显示：高表达水平的AFAP1-AS1、高组织学分级、KPS评分<80分以及术后复发均为造成胶质瘤患者不良临床预后的独立危险因素，见表2。

图2 LncRNA-AFAP1-AS1高表达组和低表达组患者术后5年生存情况

临床病理特征 单因素分析风险比 (95% CI)P值 多因素分析风险比 (95% CI)P值年龄 (<50、≥50岁) 1.012(0.687～1.948)0.274 1.744(0.954～3.221)0.079性别 (男、女) 0.974(0.559～1.542)0.304 0.908 (0.586～1.702)0.322肿瘤直径 (<4、≥4 cm) 1.545(0.864～2.889)0.136 1.245(0.745～2.351)0.214AFAP1-AS1表达水平 (低、高) 2.591(1.349～4.921)0.009 2.446 (1.334～4.647)0.012组织学分级 (I～II、III～IV) 2.312(1.297～4.507)0.014 2.864(1.502～5.554)0.003KPS评分 (低、高) 2.030(1.102～3.931)0.020 2.987(1.599～5.846)0.001术后复发 (是、否) 2.161(1.201～4.014)0.018 2.543 (1.397～4.886)0.010

讨论

LncRNAs通常被认为是一种转录副产物，没有蛋白质编码能力。但越来越多的证据表明lncRNAs广泛参与了各级基因表达的调控, 在染色质修饰、转录和转录后处理等多种类型的生物过程中起到重要作用，是目前遗传学研究的热点[19]。近几十年来, 据报道, 在致癌过程和癌症进展中，经常观察到反常表达的lncRNAs，这表明失调的lncRNAs可能作为早期癌症诊断的新的生物标志物，可以作为恶性肿瘤的有效治疗指标和预后预测靶点。例如, lncRNA HULC和lncRNA ZFAS1的高水平表达都可以促进肝细胞癌(HCC)的发生和转移[20]。而AFAP1-AS1作为AFAP1反义链上的 lncRNA，研究证明其可能通过影响 AFAP1对生理病理进程的调控，在分子机制上影响肌动蛋白与其它蛋白的连接，进而影响细胞的吞噬、运动及肿瘤的侵袭和转移[21]。Zhang等[22]发现在舌鳞癌组织中，AFAP1-AS1的表达明显高于癌旁组织，在沉默AFAP1-AS1的表达后，舌癌细胞的增殖能力减弱，且细胞周期阻滞。此外Lu等[23]发现，AFAP1-AS1在肝癌组织中的表达上调，而且其高表达与肿瘤直径、血管浸润、临床TNM分期和预后有关，说明AFAP1-AS1在肝癌的进展中发挥着致癌基因的作用。但是，AFAP1-AS1在不同级别胶质瘤中的表达量和对患者临床预后的作用却没有相关科研报道。

在我们的研究中，我们检测到AFAP1-AS1在胶质瘤组织和正常脑组织中的不同表达水平，发现相较于正常脑组织，AFAP1-AS1在胶质瘤组织中呈高水平表达，这提示我们AFAP1-AS1可以影响胶质瘤的发展和进展。接下来我们探讨AFAP1-AS1与胶质瘤临床病理特征及预后的关系，发现AFAP1-AS1过表达与KPS评分以及是否复发有关，并且也与WHO分级呈正相关。而与患者年龄、性别以及肿瘤直径等均无关。因此, 我们推测高表达AFAP1-AS1在胶质瘤中可加速肿瘤生长, 增强局部细胞侵袭和转移, 调节细胞分化。最后根据我们的随访数据，AFAP1-AS1高表达组患者的5年生存率要明显低于AFAP1-AS1低表达组。同时我们的研究证实AFAP1-AS1在肿瘤组织中的高表达、高病理级别、KPS评分<80分以及术后复发等均可作为评价胶质瘤患者不良预后的独立因素。

综上，本研究中我们证实了AFAP1-AS1在神经胶质瘤组织中的表达水显著增高，而高表达水平的AFAP1-AS1与胶质瘤患者的不良临床预后有关，可作为预测胶质瘤患者术后预后的独立因素和胶质瘤诊断的新的生物标志物。在未来，需要有更多的研究来验证AFAP1-AS1作为可靠的临床预测指标对于胶质瘤患者预后的作用。同时AFAP1-AS1在神经胶质瘤发生发展过程中的具体作用机制，以及可能参与的传导通路及分子作用靶点，也需要我们进一步深入研究。