钙激活Cl-通道蛋白在急性呼吸窘迫综合征患者体外气道上皮细胞中的表达及其作用实验研究*

郭晓雅，宋立强，梁家宁，杨学敏，陈 洁

空军军医大学西京医院呼吸与危重症医学科(西安710032)

急性呼吸窘迫综合征(Acute respiratory distress syndrome, ARDS)的病死率仍居高不下，是危重症医学临床救治的难点，主要原因是其发病机制仍不明确[1]。目前认为以中性粒细胞聚集和活化为中心的、其它炎症细胞相继参与的瀑布式炎症反应，是ARDS的主要病理生理特征，但启动机制远未阐明[2]。其中病原体直接感染呼吸道引发的肺内型ARDS是主要临床类型，约占57%[3-4]。气道上皮细胞是重要的肺脏结构细胞，直接与外界环境接触，是肺脏的第一道防御屏障。其中，气道上皮中杯状细胞的角色日益受到关注。在外界因子刺激下，它参与反应迅速的黏液-纤毛清除系统工作，应激状态下还能“旁分泌”一种特异性钙激活Cl-通道蛋白(Calcium-activated chloride channel, CLCA)。后者在人类和小鼠的基因型分别是hCLCA1和mCLCA3，两者异种同源。最初认为CLCA是跨膜蛋白，目前确认CLCA是分泌型蛋白，其裂解的N端肽段对Cl-通道具有调节作用，能调节黏液蛋白的合成[5-6]。近年多项研究证实，“产生过量”的CLCA与气道炎症性疾病(包括哮喘、COPD和肺囊性纤维化等)的发生及程度密切相关[7-10]。目前未能检索到CLCA与ARDS相关性的研究报道。基于此，本课题组拟探讨气道上皮分泌的CLCA在ARDS发生机制中的变化及作用，本实验从体外细胞水平初步探讨其作用，旨在为临床ARDS的防治提供新的靶点。

资料和方法

1 材 料

1.1 细胞系：本实验使用正常人支气管上皮细胞HBE细胞系，购自ATCC并由实验室培养并保存。

1.2 试 剂：1%戊巴比妥钠(Sigma公司，美国)；LPS(Escherichia coli055:B5)(Sigma公司，美国)；生理盐水(saline)(Sigma公司，美国)；DMEM培养基(GIBCO公司，美国)；胎牛血清(FBS)(GIBCO公司，美国)；胰酶(GIBCO公司，美国)；DEPC水(北京天为时代科技公司 )；Trizol细胞裂解液(Invitrogen公司，美国)；反转录试剂盒(TOYOBO公司，日本)；SYBR Green Real-time PCR Master(TOYOBO公司，日本)；real-time RT-PCR mCLCA3 引物(上海生工生物工程有限公司)；real-time RT-PCR β-actin 引物(上海生工生物工程有限公司)；兔抗鼠mCLCA3一抗(Abcam公司，美国)；鼠抗鼠β-actin一抗(Abcam公司，美国)；山羊抗兔二抗(Abcam公司，美国)；山羊抗鼠二抗(Abcam公司，美国)；蛋白酶抑制剂Cocktail(Sigma公司，美国)；RIPA 裂解液(碧云天公司，中国)；BCA 蛋白试剂盒(Bio-Rad公司)；Western Blot相关试剂(碧云天公司，中国)；4×Laemmli Sample Buffer(Bio-Rad公司)；Millipore chromogenic kit显影液(Billerica公司)。由Primer5.0软件设计TNF-α(Gene-ID 21926)、IL-1β(Gene-ID 16176)引物，由上海生工生物工程有限公司合成。TNF-α上游引物为5-TATGTCTCAGCCTCTTCTCA-3，下游引物为5-GCCATAGAACTGATGAGAGG-3，产物长度为133bp。IL-1β上游引物为5-CTTTTCGTGAATGAGCAGAC-3，下游引物为5-CTCTTTGAACAGAATGTGCC-3，产物长度为107bp。内参基因β-actin(Gene-ID 11461)引物由上海生工生物工程有限公司合成。β-actin上游引物序列是：5-TGTATGAAGGCTTTGGTCTC-3，下游引物序列是：5-GGTGTGCACTTTTATTGGTC-3，产物长度为96bp。

2 实验方法

2.1 正常人支气管上皮细胞HBE细胞系培养：本实验使用正常人支气管上皮细胞HBE细胞系，培养于含有10%胎牛血清(FBS)、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素(双抗)的DMEM培养基中，置于5%CO2、37℃的孵箱中培养。

2.1.1 运用LPS刺激HBE细胞系：每孔加入无FBS的DMEM培养基，饥饿6h。利用LPS(10mg/ml)过滤，避光。按照每孔1μg/ml的量进行刺激。将实验共分四组，每组设三个复孔，分别为生理盐水组(saline组)、LPS刺激持续6h组(LPS-6h组)、LPS刺激12h(LPS-12h组)和LPS刺激24h(LPS-24h组)。

2.1.2 Western Blot检测hCLCA1蛋白在HBE细胞系中的表达。

2.2 RIPA法提取HBE细胞系总蛋白：弃培养基，用冷PBS洗细胞3次。加入适量RIPA裂解液(使用前数分钟向20 ml RIPA中加入两片蛋白酶抑制剂Cocktail)，置于冰上。用干净的刮子将细胞刮至一侧，然后移入EP管中，-80℃冰融1次。取出，解冻，12000 rpm低温离心5 min。 取上清，并移入新EP管中，-80℃保存。之后煮蛋白：依照测得的蛋白浓度，按照上样量为25 μg计算上样体积(μl)，分装于10个小EP管中。每管加入5×sample beffer(提前解冻)，其体积为蛋白体积/4，即稀释为1×。混匀，离心，上机，程序为：Run-Main-DB(95℃，5 min)。

2.3 Western Blot法检测HBE细胞系中hCLCA1蛋白的表达：蛋白电泳时，每孔上样量10 μl，通过Western Blot法检测HBE细胞系中hCLCA1蛋白的表达情况。

2.4 hCLCA1-siRNA转染HBE细胞系：实验分为阴性对照组(NC组)、空白对照组(Control组)、转染组(hCLCA1-siRNA组)、刺激组(LPS组)和转染+刺激组(hCLCA1-siRNA+LPS组)。将HBE细胞接种于12孔板，用不含抗生素的DMEM培养基培养细胞，待细胞长至80%～90%转染hCLCA1-siRNA。用不含血清的DMEM培养基稀释质粒，加入Lipofectamine 2000，轻轻混匀；在5 min之内将稀释的Lipofectamine 2000分别与hCLCA1-siRNA轻轻混匀，室温静置20 min；将转染试剂混合液分别加入每个孔内，轻摇孔板混匀；37℃的CO2孵箱里孵育4～6 h，换成含血清DMEM培养基；转染后培养48 h，加或不加LPS处理细胞24 h，收集mRNA与细胞蛋白，低温保存。

2.5 利用real-time RT-PCR法鉴定hCLCA1基因是否被特异性抑制。

2.5.1 HBE细胞系总RNA提取：用0.1%DEPC水消毒实验耗材，烘干备用。收集HBE细胞，PBS灌洗3次。弃去PBS，每孔加入1mlTrizol裂解液，吹打至细胞脱壁，移入新去酶EP管中。反复冰融一次让细胞充分裂解。

2.5.2 检测HBE细胞系总RNA浓度：将提取好的总RNA混匀，瞬离后取2μl RNA加入98μl DEPC水中，即稀释50倍，混匀上机。OD(260/280)值低于1.8提示蛋白质污染严重；高于2.0提示RNA降解严重。选取OD值在1.8～2.0之间且浓度高者为模板进行下一步逆转录操作。

2.5.3 real-time RT-PCR检测炎症因子TNF-α和IL-1β的表达：利用RNA反转录试剂盒，通过 real-time RT-PCR引物设计，通过real-time RT-PCR取得各组样品后，利用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测各组细胞系中TNF-α和IL-1β的表达水平。

结果

1 Western Blot检测HBE细胞系中hCLCA1蛋白的表达情况 Western Blot法对HBE细胞系进行hCLCA1蛋白表达水平检测(图1)，显影结果显示：在约100KD处，LPS-6 h组的HBE细胞系出现条带与对照组并无差异，而LPS-12h组和LPS-24 h组的HBE细胞系出现条带的亮度明显低于对照组，且LPS-24 h组hCLCA1的降低有统计学差异(P<0.05)，证明hCLCA1蛋白在LPS12 h后的HBE细胞系中表达水平降低，并呈时间依赖性。

2 从mRNA分子水平鉴定hCLCA1基因被特异性抑制 real-time RT-PCR对细胞内hCLCA1基因表达检测，扩增结果显示：转染hCLCA1-siRNA后，HBE细胞系中，hCLCA1的mRNA表达水平低于NC组(P<0.05)。hCLCA1基因的表达明显受到抑制，hCLCA1-siRNA对目的基因的抑制效率达到70%以上(图2)。

3 real-time RT-PCR法检测HBE细胞系中炎症因子TNF-α和IL-1β的表达情况 real-time RT-PCR对细胞内TNF-α和IL-1β基因表达检测(图3)，扩增结果显示：LPS组细胞中的TNF-α和IL-1β的mRNA表达水平明显高于Control组，hCLCA1-siRNA+LPS组细胞中的TNF-α和IL-1β的mRNA表达水平均明显高于LPS组细胞(P<0.05)。

图1 Western Blot检测HBE细胞系中hCLCA1蛋白表达情况

图2 real-time RT-PCR检测细胞内hCLCA1基因表达情况

图3 real-time RT-PCR检测细胞内TNF-α和IL-1β基因表达情况

讨 论

ARDS是一种急性、弥漫性、炎症性肺损伤，其治愈率低，病死率居高不下，是危重症医学临床救治的难点。怎样降低ARDS的发生率是极其重要的临床处置思路，实现这一目标的关键点是阐明ARDS失控的炎症风暴的始动机制。目前认为炎症反应和免疫反应在ARDS的病理生理发展过程中发挥着关键作用[11]。炎症反应影响了肺泡上皮细胞及血管内皮细胞等组织细胞的结构与功能，后者也参与了ARDS的炎症反应[12]。然而，支气管上皮细胞在ARDS发生中的角色还关注得远远不够。特异性钙激活氯离子通道蛋白(简称CLCA)，系气道上皮杯状细胞旁分泌型蛋白。CLCA在哮喘、COPD等慢性炎性疾病中高度活跃，能促进气道黏液高分泌症状的形成，其在这些疾病慢性炎症发生中的角色逐渐被人们关注。近年来多项研究显示，CLCA也参与肺部感染性炎症的形成，并与ARDS病情相关[13-14]。但是，CLCA表达水平与ARDS损伤程度的相关性及作用机制，目前尚不清楚，本实验组初步从体外细胞水平探讨CLCA在ARDS气道上皮细胞水平的表达及调控情况。脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)是革蓝氏阴性杆菌细胞壁上促炎的主要成分，可以通过结合Toll样受体(TLR4)和激活TLR4-MyD88依赖的信号通路(TLR4-MyD88 dependent signaling pathway)启动强烈的炎症反应，给动物一定剂量LPS后会引发动物肺组织内细胞因子及趋化因子的产生，随着炎症反应的加重，导致动物肺内型ARDS的发生。因此常被实验室用来建立LPS诱导的肺内型ARDS模型[15]。 LPS可以直接诱导培养人气道黏液细胞分泌hCLCA1[16]。本实验中运用LPS刺激正常人支气管上皮细胞系(HBE)，观察hCLCA1蛋白在离体水平的表达情况，为进一步研究CLCA的作用及机制提供理论基础。

在本研究探讨了CLCA在ARDS体外气道上皮细胞系中的表达情况，以及抑制CLCA后，ARDS体外气道上皮细胞系中炎症水平的波动情况。实验结果显示，16HBE细胞系加LPS(1μg/ml)刺激6h后hCLCA1的蛋白表达量与对照组相比无明显差异，但是在LPS刺激12h后开始下降，在LPS刺激24h后hCLCA1的蛋白表达量明显低于对照组，其随时间推移，呈逐渐减少趋势。本研究中，我们进一步特异性下调人hCLCA1表达的siRNA质粒转染至正常人支气管上皮细胞HBE细胞系中，观察到特异性降低hCLCA1的表达后，可提高HBE细胞的炎症因子TNF-α和IL-1β的mRNA表达水平。既往多项研究提示CLCA可通过调节炎症细胞参与哮喘、COPD等慢性炎性疾病过程，而且既往我们实验组发现，炎症因子TNF-α和IL-1β在ARDS炎症损伤的形成和发展中扮演着重要角色[17]。因此，我们通过本研究可以证实CLCA在体外气道上皮细胞水平参与了ARDS的炎症损伤过程，此结果需进一步的体内研究来证实。

鉴于对以上细胞水平实验结果，我们推测，CLCA很可能在ARDS的致病过程中能够保护机体，拮抗炎症反应的发生。对于CLCA在ARDS动物模型体内表达情况，及其如何实现对炎症因子的反向调控尚不清楚，我们进一步将继续展开体内及其分子机制的研究工作。