乳腺癌术后服用他莫昔芬患者子宫内膜中PTEN 的表达

李羽禾 何 玥 吴玉梅

首都医科大学附属北京妇产医院妇瘤科，北京 100006

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，发生率及死亡率高，约有60%～80%的乳腺癌患者雌激素受体和/或孕激素受体阳性［1］，他莫昔芬（TAM）是雌激素受体和/或孕激素受体阳性的绝经前乳腺癌患者的一线辅助治疗用药［2］，但长期服用可增加子宫内膜病变及癌变风险，但发生机制尚不清楚。PTEN（第10 号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因）是子宫内膜癌中突变率最高的基因，被公认为是子宫内膜的“看家基因”［3］。故本研究选取乳腺癌术后服用TAM 患者，以Ⅰ型子宫内膜腺癌患者及正常子宫内膜为对照，采用免疫组化法检测PTEN 蛋白的表达。旨在探讨PTEN 是否参与乳腺癌术后服用TAM 相关的子宫内膜病变。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018 年1～12 月首都医科大学附属北京妇产医院（以下简称“我院”）随诊的乳腺癌术后服用TAM（20 mg/d）的患者56 例。其中因阴道不规则出血或定期随访B 超提示子宫内膜异常增厚，住院行宫腔镜诊刮术获得子宫内膜标本的患者10 例，拟定为乳腺癌术后服用TAM 组；因“宫颈上皮内瘤变Ⅲ级或子宫肌瘤”行全子宫切除术的正常子宫内膜患者10 例，拟定为正常子宫内膜组；初治的Ⅰ型子宫内膜腺癌患者10 例，拟定为子宫内膜癌组。其中正常子宫内膜组及子宫内膜癌组为对照组。三组一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性，见表1。本研究经我院医学伦理委员会批准。

纳入标准：①乳腺癌术后服用TAM 超过6 个月且患者病例资料完整；②患者知情同意并签署知情同意书。排除标准：①6 个月内曾服用其他内分泌治疗药物；②合并其他恶性肿瘤；③曾行放化疗及免疫治疗者。

1.2 方法

1.2.1 试剂 他莫昔芬（上海华联制药公司，批号：H10910072），兔抗人PTEN 多克隆抗体（美国Abcam公司，货号：ab31392）。S-P 谱超敏试剂盒（迈新生物有限公司，批号：1806073825），二氨基联苯胺（DAB）酶底物显色剂（迈新生物有限公司，批号：180508441C），使用XDS-100 倒置荧光显微镜（上海蔡康光学仪器有限公司）进行观察。

表1 三组患者的一般资料比较

1.2.2 标本制作 乳腺癌术后服用TAM 组、正常子宫内膜组及子宫内膜癌组中PTEN 蛋白在子宫内膜组织中的表达情况采用免疫组化染色法测定。子宫内膜组织离体后放入甲醛溶液（同和生物，批号：18032401）固定，石蜡包埋、切片、常规脱蜡、水化、孵育、抗原修复，连续切片，切片厚度4 μm，每例切片6 张。随后按照免疫组化试剂盒所示步骤进行，DAB 显色，苏木精复染，脱水，封片。

1.3 观察指标

PTEN 蛋白阳性表达为棕黄色或棕褐色颗粒，主要位于细胞质中，偶可见于细胞膜和/或细胞核。每例均随机观察5 个高倍视野。PTEN 蛋白定量表达采用半定量积分法；定性表达采用主观分级记录，染色强度评分：阴性为0 分，弱强度为1 分，中等强度为2 分，高强度为3 分；染色阳性率评分：阳性率≤5%为0 分，＞5%～25%为1 分，＞25%～50%为2 分，＞50%～75%为3 分，＞75%～100%为4 分。总评分=染色强度评分×染色阳性率评分，0 分为阴性（-），1～4 分为弱阳性（+），5～8 分为中度阳性（++），9～12 分为强阳性（+++）。

1.4 统计学方法

采用SPSS 25.0 统计学软件进行数据分析，计数资料采用百分率表示，采用Fisher 精确概率法；符合正态分布计量资料用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，不符合正态分布的计量资料改用中位数（M）和四分位数（P25，P75）表示，两组间比较采用非参数检验及Kruskal-Wallis H 检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PTEN 蛋白染色情况

三组PTEN 蛋白主要位于腺上皮细胞的细胞质中。正常子宫内膜组，细胞质中棕黄色颗粒分布均匀，未见缺失，见图1A；子宫内膜癌组，细胞质中棕黄色颗粒均较正常，见图1B；乳腺癌术后口服TAM 组，细胞质中棕黄色颗粒明显减少，部分细胞棕黄色颗粒呈缺失状态，见图1C。

2.2 三组PTEN 蛋白定量表达情况

三组PTEN 蛋白定量表达情况比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；子宫内膜癌组PTEN 蛋白低于正常子宫内膜组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 三组PTEN 蛋白定量表达情况［分，M（P25，P75）］

2.3 三组PTEN 蛋白定性表达情况

子宫内膜癌组表达强度低于正常子宫内膜组，乳腺癌术后服用TAM 组表达强度低于正常子宫内膜组。见表3。

表3 三组PTEN 蛋白定性表达情况（例）

3 讨论

3.1 乳腺癌国内外进展及内分泌治疗情况

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤。在中国，乳腺癌的死亡率逐年上升，严重威胁女性的生命和健康，成为社会的巨大负担［4-7］。乳腺癌治疗方式有手术联合放化疗、内分泌治疗、靶向治疗等。雌激素受体阳性的乳腺癌患者，内分泌治疗占有十分重要的地位。TAM是一种选择性雌激素受体调节剂（SERM)，用于乳腺癌治疗已超过30 年，是非常有效的乳腺癌术后一线辅助治疗药物，可显著降低乳腺癌的复发风险［8-12］。2018 年NCCN 乳腺癌指南［13］推荐，绝经前首选TAM治疗5 年，如仍未绝经，则继续使用至10 年，显著降低复发率和死亡率［14］。

长期服用TAM 后月经多不规律，甚至绝经，体内呈现低雌激素状态。TAM 有弱雌激素作用，随着服用时间的增加，剂量累积，可引起一系列妇科病变，包括子宫内膜增生、息肉、肉瘤和癌变［15-17］。TAM 相关子宫内膜癌患者病理级别通常为更高级别，临床预后较差［18］，但具体机制尚无定论，因此了解其分子机制对于制订治疗策略并减少TAM 对子宫内膜的影响至关重要。明确TAM 相关子宫内膜病变的早期分子标志物，可有效预测子宫内膜病变的发生，为进一步研究打下基础。

3.2 PTEN 与子宫内膜癌的相关性

目前Ⅰ型子宫内膜癌最常见的分子标志物有5 种，包括PTEN、PIK3CA、K-ras、β-catenin。PTEN 是10 号染色体上缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物基因［19］，属于抑癌基因，是Ⅰ型子宫内膜癌中发现的最早和最常见的遗传改变之一，被称做子宫内膜的“看家基因”［20］。PTEN 可通过调控细胞内PIP3 含量从而调控细胞生长。PIP3 位于细胞膜，是细胞生长调控的重要通路之一，活化的PIP3 可激活细胞周期蛋白依赖激酶，使细胞从G1期进入S 期，促进细胞生长及增殖。PTEN 有脂质磷酸酶和蛋白磷酸酶活性，使PIP3 去磷酸化，降低细胞内PIP3 水平，从而使细胞停止在G1期，阻止细胞生长，诱导细胞凋亡［21］。PTEN 在Ⅰ型子宫内膜癌中的突变率为35%～83%，在至少20%的子宫内膜癌前病变中功能完全丧失或突变［22-23］。提示PTEN 表达缺失不仅限于子宫内膜癌，在子宫内膜增生中就已存在，是Ⅰ型子宫内膜癌的早期分子事件［16］。本研究对Ⅰ型子宫内膜癌组织进行免疫组化检测，发现细胞质中棕黄色颗粒明显减少，部分完全缺失；半定量积分法发现，子宫内膜癌组PTEN 蛋白表达量低于正常子宫内膜组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

3.3 乳腺癌术后服用TAM 导致子宫内膜病变可能的分子机制

越来越多学者致力于研究PTEN 与TAM 导致子宫内膜病变的相关性，Holtz 等［23］研究显示，在有乳腺癌史的子宫内膜癌患者中，服用TAM 与未服用TAM患者的子宫内膜组织中PTEN 蛋白表达无明显差异。Prasad 等［24］研究显示，在有乳腺癌史的女性中，与TAM相关子宫内膜癌含有与散发性子宫内膜癌相似的遗传改变，为TAM 导致子宫内膜病变可能的分子机制提出了新思路。郭蕾等［25］研究发现，绝经期妇女服用TAM，PTEN 外显子突变率明显高于正常组，而与子宫内膜癌组差异无统计学意义，提出PTEN 可能是TAM导致子宫内膜病变的早期分子事件。本研究中，三组PTEN 蛋白定量表达情况比较，差异有统计学意义（P＜0.05），提示TAM 的弱雌激素作用，使得子宫内膜长期处于增殖状态，引起PTEN 蛋白表达进一步减少，导致子宫内膜病变；乳腺癌术后服用TAM 组与正常子宫内膜组中PTEN 蛋白表达比较，差异无统计学意义，可能是由于样本量较小，差异不明显所致；且PTEN 蛋白定性分析显示乳腺癌术后服用TAM 组PTEN 蛋白表达强度有明显降低趋势。

综上所述，服用TAM 可能出现PTEN 蛋白的表达逐渐减少，影响相关通路，使子宫内膜呈持续增生改变，进而发展为子宫内膜癌。马雪莲等［26］研究指出，TAM 通过效应分子miR-1297 的异常表达发挥作用，引发其下游靶基因PTEN 的表达发生改变，致使P13K/P-ATK 途径激活，P-ATK 表达上调，细胞异常增殖，逃逸凋亡，导致子宫内膜异常增生、发生癌变。本研究局限性在于样本量较少，将会开展更大样本的研究，专注于PTEN 与TAM 相关子宫内膜病变之间的关系及具体机制。明确TAM 相关子宫内膜病变机制，即可为下一步研究打下基础，亦可指导乳腺癌内分泌治疗的临床用药。