苯甲酸、富马酸及其复合酸对常见致病菌体外抑菌效果的研究

董瑷榕，苗建军，郭春华，杨加豹，周 勇

(1.西南民族大学生命科学与技术学院，动物科学国家民委重点实验室，四川 成都 610041；2.四川省畜牧科学研究院，动物遗传育种四川省重点实验室，四川 成都 610066)

抗生素的滥用已给人们带来了严重的后果，为改善这种局面，维持养殖业高水平的生产力，寻找安全高效的抗生素替代品己成为动物营养领域的热点之一.有机酸具有长期用作食品添加剂和防腐剂的历史，用于防止食品变质和延长易腐食品成分的保质期[1].有研究表明，饲粮中添加有机酸能够改变动物肠壁的形态，减少肠道中病原菌的数量以及细菌产生的毒性物质，且对动物本身的影响较低，因此，有机酸在动物生产中的应用研究日趋增多[2-5].由于仔猪的许多机能尚不成熟，导致抗生素在仔猪日粮中的滥用状况相对普遍，而饲用有机酸的应用可以发挥较好的替代抗生素的作用.有报道称，将有机酸添加到仔猪日粮中能够增加仔猪胃肠酸度，提高增长率、营养消化率和酮体品质[6].

苯甲酸大部分以马尿酸方式经尿液排出，很少在体内富集[7]，因此，猪饲粮中添加苯甲酸不会增加酸负荷，扰乱机体的酸碱平衡.富马酸，又名延胡索酸，参与三羧酸循环和鸟氨酸循环等过程，对于机体的代谢具有重要作用.有研究表明，将苯甲酸或富马酸加入断奶仔猪日粮中，可降低仔猪死亡率和腹泻率、改变肠道微生物的数量、改善饲料的转化率，进而提高生长性能[8-11].目前关于苯甲酸与富马酸有机酸抑菌试验的报道中，大多是研究苯甲酸与富马酸两种有机酸单一的抑菌效果，对于两种酸组合搭配后抑菌效果的研究鲜有报道.本研究用牛津杯法对三种酸进行体外抑菌试验，通过测定苯甲酸、富马酸及两种酸组合的复合酸对大肠杆菌、沙门菌和金黄色球菌抑菌圈的大小，评定其抑菌效果，为有机酸在动物生产中的应用提供数据支持.

1 材料与方法

1.1 试验材料

苯甲酸、富马酸(纯度均为99.5%)，购自帝斯曼中国有限公司

1.2 试验菌种

大肠杆菌(ATCC83912)、沙门菌(ATCC21512)和金黄色葡萄球菌(ATCC65213)均由西南民族大学生命科学与技术学院动物营养与饲料科学专业实验室保藏.

1.3 试验试剂及仪器

胰酪大豆胨液体培养基(TSB)(青岛高科园海博生物技术有限公司);YXQ-LS-50S立式压力蒸汽灭菌器(上海博迅实业有限公司);GHP-9270隔水式恒温培养箱(上海一恒科学仪器有限公司);UV1810S紫外可见分光光度计(上海佑科仪器仪表有限公司);DY-200B全温型恒温培养摇床;牛津杯(成都市科隆化学品有限公司).

1.4 试验方法

1.4.1 菌液的制备

取适量原菌液划线接种于营养琼脂平板上，恒温培养箱中37℃培养12～16 h后，挑取单菌落接种于10 mL液体培养基中，摇床37℃培养3 h后在波长为600 mm下测定OD值，当OD值达到0.5左右停止培养.取活化的菌液，用无菌生理盐水依次稀释至10-6，将菌液浓度调至1.0～2.0×108cfu/mL，4℃冰箱保存备用[12-15].

1.4.2 有机酸溶液的制备

单一有机酸的配制：准确称取苯甲酸和富马酸各2.00 g，分别用无菌水溶解定容后使其浓度为2.00 g/mL后备用.分别取母液用无菌水进行逐级稀释，稀释终浓度分别为 0.25、0.50、0.75、1.00 g/mL.

复合酸的配置：分别称取苯甲酸和富马酸各0.025、0.05、0.075 和0.10 g，分别按1：1 比例进行混合，用无菌水作为溶剂，制备质量浓度为0.25、0.50、0.75、1.00 g/mL的母液备用.

1.4.3 抑菌试验

牛津杯法又称管碟法[14].每平板内倒入15 mL固体培养基，待培养基凝固后，移液枪分别取100 μL三种指示菌菌液，均匀涂布于固体培养基上，每种指示菌设三个重复，根据酸溶液的不同分别分为A、B、C三个小组.每个平板中放置5个牛津杯，自然沉落，使牛津杯稳固，其中四个牛津杯中各加入100μL同种酸的四种浓度溶液，另外一个牛津杯用无菌水做空白对照，并依次做好标记.放置于37℃恒温培养箱培养，每小时观察一次，待抑菌圈形成后，用游标卡尺测量抑菌圈直径，计算平均值[14.16].比较抑菌圈大小，抑菌圈直径＜5 mm为无抑菌或抑菌不明显，用“-”表示;5～10 mm为低敏感度，用“+”表示;10～15 mm为中敏感度，用“++”表示;抑菌圈直径＞15 mm为高敏感度，用“+++”表示[17].

1.4.4 数据处理与统计分析

试验数据采用Excel 2010进行初步处理，然后用SPSS 18.0统计分析软件进行二因素方差分析，并用Duncan法进行多重比较，结果采用平均值±标准差形式表示.P＞0.05表示差异不显著，P＜0.05表示差异显著.

2 结果与分析

2.1 有机酸对致病菌抑菌效果的影响

由表1可知，苯甲酸、富马酸及两种酸的复合酸均对三种菌的生长产生显著的抑制作用(P＜0.05).就极差(R)而言，苯甲酸对大肠杆菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌的R值分别为7.09、6.83、7.09，说明苯甲酸对沙门菌的抑菌效果最小.富马酸对大肠杆菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌的R值分别为7.00、6.54、6.97，说明富马酸对大肠杆菌的抑菌效果最大，对金黄色葡萄球菌次之，沙门菌最小.复合酸对大肠杆菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌的R值分别为6.69、6.70、6.99，说明复合酸对金黄色葡萄球菌的抑菌效果最大，对沙门菌次之，大肠杆菌最小.其中，复合酸对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果显著优于富马酸和苯甲酸单一使用的效果(P＜0.05)，而对于沙门菌的抑菌效果，富马酸要显著低于苯甲酸和复合酸(P＜0.05);随着有机酸浓度的升高，抑菌圈直径显著增大，抑菌作用显著增强(P＜0.05).有机酸种类和浓度二因素对大肠杆菌的抑菌作用无显著的互作影响(P＞0.05)，但对沙门菌和金黄色葡萄球菌存在显著的互作影响(P＜0.05)，均以添加质量浓度为1.00 g/mL的复合酸抑菌效果最优.

表1 不同浓度的有机酸体外抑菌试验结果(mm)Table 1 Results of bacteriostasis test of different concentrations of organic acids in vitro(mm)

注：同列数据肩标相同或者无字母肩标表示差异不显著(P＞0.05)，不同小写字母表示差异显著(P＜0.05).

2.2 有机酸对致病菌抑菌效果的表观评估

对抑菌圈进行表观评估，结果见表2.由表2显示，当质量浓度为0.25 g/mL时，复合酸对三种致病菌抑菌圈远高于苯甲酸与富马酸;当质量浓度为0.50 g/mL时，复合酸对金黄色葡萄球菌的抑菌效果达到高敏感度，而两种单一酸的效果均为中敏感度，但三种酸对大肠杆菌和沙门菌未出现明显差异，均为中敏感度;当质量浓度为0.75 g/mL时，复合酸对三种致病菌的抑菌效果已全部达到高敏感度水平，而两种单一酸只达到了中敏感度;当质量浓度为1.00 g/mL时，三种酸的抑菌效果均达到高敏感度.以上结果显示，复合酸对三种致病菌的抑菌效果均大于单一使用两种酸的效果.

表2 有机酸对致病菌的抑菌效果Table 2 Inhibition effect of organic acids on bacteria

3 讨论

致病性大肠杆菌、沙门菌和金黄色葡萄球菌能够引起畜禽多种肠道和体外疾病，是危害养殖业的重要病原.Bühler[8]等指出，苯甲酸对大多数微生物有抑制作用，自2013年苯甲酸被授权作为饲料添加剂起，苯甲酸开始应用在生长肥育猪的日粮配方中，对猪的肠道健康起到一定的保护作用.段晨磊[18]等报道称：富马酸可作为一种饲料防霉剂，对真菌和细菌均有抑制作用，在动物饲料中添加一定量的富马酸可降低有害微生物的数量.在本试验设置的浓度下，牛津杯周围出现了明显的抑菌圈，验证了苯甲酸、富马酸及其复合酸对大肠杆菌、沙门菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用.质量浓度0.25 g/mL为三种酸最小抑菌浓度，且随着浓度的增加，抑菌效果越明显，即抑菌圈的直径越大，抑菌作用越强[19];质量浓度为0.5～1.0 g/mL时，三种酸均具有明显抑菌效果，1.0 g/mL为最佳的抑菌浓度，可作为饲料添加剂候选浓度使用;复合酸对于革兰氏阳性菌的抑菌效果优于革兰氏阴性菌，且优于两种有机酸单一使用时的效果，具有广谱抑菌性.

有机酸主要通过大分子的合成、能量的竞争、提高胞内渗透压、诱导宿主产生抗菌肽等方面来达到抑菌目的[20].在本试验中，随着苯甲酸浓度的增加，抑菌圈越大，抑菌效果越明显.这可能是因为苯甲酸是一种弱酸，在溶液中解离状态下的弱酸根离子存在着一种动态平衡.低浓度下，此时的分子多数处于未电离状态，没有电离的有机弱酸分子具有亲脂性，因此可以自由透过细菌细胞膜，进入细菌细胞内，苯甲酸分子不断进入细菌细胞，使细胞内H+的失衡，改变细胞内pH的状态及减少毒性阴离子.抑制细胞的基础代谢反应，改变细胞膜的通透性，细胞内的蛋白质变性，细胞内呼吸酶系统和电子传递酶系统的活性受到抑制，最终达到抑菌目的[21-23].对于富马酸而言，其抑菌机理与苯甲酸不同.富马酸是有机酸在动物营养应用中一种比较重要的有机酸，它可参与机体内能量代谢途径;在动物饲料中应用比较广泛，因为它能调节机体内酶活性和参与能量代谢等一系列生化反应，富马酸能够损坏微生物的细胞壁和细胞膜，从而使富马酸分子穿过细菌细胞壁，进入细胞，抑制胞内各种酶的合成，抑制细胞代谢的活性，导致细菌生长受抑，富马酸与其他抗菌剂配合使用能增强其抑菌效果[19.23].富马酸对于胃肠道的微生物抑制机制主要有两种，一是富马酸分子穿过微生物细胞膜，阻止DNA的合成，减少微生物菌群;二是抑制微生物的三羧酸循环来达到抑菌的目的，具有双重抑菌效果[24-25].本试验发现，虽然苯甲酸与富马酸抑菌机理不同，但均对大肠杆菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌的生长有抑制作用，本试验结果中，复合酸的抑菌圈直径大于单一使用的两种酸，说明复合酸的抑菌效果优于苯甲酸与富马酸单一使用的效果.这可能是因为复合型酸结合了两种酸的抑菌机理，在两种酸的协同作用之下，一方面能够穿过细胞膜，破坏细菌细胞壁，改变细胞膜的通透性，从而使细胞内的蛋白质变性;另一方面又能够抑制细菌细胞膜内一些酶的活性，阻止细菌生长.秦胜涛等[18]也指出，在酸化剂解离度各不相同和协同抑菌的理论基础上，为达到更好的抑菌效果，可以选择一些解离度大的酸来降低pH，选择一些解离度小的酸来杀菌，在几种酸的协同作用下，共同抑菌.苯甲酸属于解离度大的酸，降低了溶液的pH值，而富马酸的解离度比较小.本试验同浓度下，复合酸在两种酸互补协同作用下，抑菌效果达到最好.国内外对饲料中有机酸结合力的研究主要集中在对猪饲料酸结合力的测定及酸结合力对仔猪生产性能的影响，而缺乏有机酸结合力与组成饲料原料配比之间的定量关系的研究，从而难以确定饲料中有机酸结合力达到最佳水平时酸化剂的添加水平[23].

目前有机酸已被广泛应用于仔猪与家禽饲料等领域，效果显著，长期使用同一种抗菌酸，会使细菌对其产生一定的抗抑机制，抑菌效果存在一定的局限性，本试验发现复合酸的抑菌效果比两种有机酸单一使用时的效果更理想，因此复合酸的使用不仅可以解决细菌的抗抑制问题，还可提高抑菌效率.考虑到有机酸在实际生产中的应用，因不同种类有机酸价格差异较大，复合酸的使用可针对单一有机酸的价格，形成高低搭配，降低成本.有机酸作为饲料添加剂的使用仍存在一系列问题，如使用效果尚不稳定，不易制成预混料等，因此对其在实际生产中的应用还需进一步探讨.

4 结论

本次研究结果表明，苯甲酸、富马酸及其复合酸均具有明显的体外抑菌活性，且呈浓度-效应关系.此外，有机酸的抗菌活性还与不同有机酸制剂有关，复合酸在0.25～0.75 g/mL浓度下，显示出比苯甲酸、富马酸单一酸更优良的广谱抑菌活性，表明了苯甲酸、富马酸按1：1制备的复合酸作为饲料添加剂具有市场推广使用的价值.