关于荧光定量PCR在预测微生物学中的运用分析

韦兰芳

【摘   要】 预测微生物学是由计算机、微生物与统计学等学科综合而成的一种新型学科，主要利用数学语言对微生物生长与死亡规律进行预测、描述。荧光定量PCR主要利用荧光信号对聚合酶链式反应进程进行监测，通过标准曲线定量分析位置模板。本文主要对荧光定量聚合酶链式反应技术进行研究，并对其在预测微生物学中运用进行分析，以供相关人士参考。

【关键词】 预测微生物学;运用分析;荧光定量聚合酶链式反应

Application and Analysis of fluorescent quantitativePCR in predicting Microbiology

Wei Lanfang

（Anhui Kebo Product testing Research Institute company Ltd.   230000）

[Abstract] Predictive microbiology is a new kind of discipline， which is composed of computer， microorganism and statistics. It mainly uses mathematical language to predict and describe the law of microbial growth and death. Fluorescence quantitative PCR mainly uses fluorescence signal to monitor the process of polymerase chain reaction and quantitative analysis of position template by standard curve. In this paper， the technology of fluorescent quantitative polymerase chain reaction （FQPCR） is studied， and its application in predictive microbiology is analyzed for the reference of relevant people.

[Keywords] predictive microbiology; applied analysis; fluorescence quantitative polymerase chain reaction

聚合酶链式反应技术源于国外，能够导致核算暴增，促进微观分子可视化。在生物科学技术快速发展过程中，聚合酶链式反应技术要求越来越高，从而产生了荧光定量聚合酶链式反应。因为荧光定量聚合酶链式反应技术具有高效与特异等优点，所以在医药卫生、微生物与农业等科学领域中具有广泛应用空间。在微生物应用过程中需要通过科学技术进行预测，判断微生物产品是否安全、可靠。

1  荧光定量PCR技术

1.1  技术原理

荧光定量聚合酶链式反应技术有水解探针法与荧光染料法等。水解探针法主要能够将探针完整性破坏掉，导致能量传递结构出现不稳定现象而崩溃，从而出现荧光信号。当聚合酶链式反应一轮之后便可以收集到一次荧光信号，从而对整个反应过程进行动态检测。染料法属于常用检测技术，主要通过绿色激发波长染料和DNA双链小沟结合产生荧光信号，且信号收集量和聚合酶链式反应产物增加量相等[1]。较传统技术方法而言，荧光定量聚合酶链式反应技术能够确定优势微生物群落，良好功能微生物类群。在荧光定量聚合酶链式反应技术应用过程中可能会发生假阳性，在样本定量分析时可通过死菌DNA结合避免其扩增。

1.2  特征

通常情况下PCR产物都需要通过琼脂糖凝胶电泳与溴化乙锭染色紫外光的观察结果来进行检测，不仅需要耗费大量时间，还需要使用多种仪器设备，且染色剂对于人体存在着一定的危害。荧光定量PCR克服了传统PCR的一些缺陷，主要表现在以下几个方面。

1.2.1  特异性    荧光定量PCR具有非常良好的准确性，原因在于它使用针对靶序列设计的特异性探针对定量分子进行识别，探针与引物的双重控制模式下，假阳性低，可以最大化保障试验结果的准确性。

1.2.2  线性关系    荧光信号的出现与扩增产物之间呈现出对应的关系，荧光信号检测可以直接对产物进行定量操作。

1.2.3  高灵敏度    荧光定量PCR检测技术综合了多种技术手段，包括PCR技术、激光技术、数码现象技术等在内，检测灵敏度有所保证。

1.2.4  操作简便    该技术的自动化水平较高，无论是扩增还是检测环节都可以在全封闭的管內进行，降低了溴化乙锭可能产生的影响。另外，在不需要开盖的前提下可以实现扩增与检测的同步完成，无需后期处理，在3h内完成多个样品的定量分析。

2  预测微生物学运用

2.1  临床微生物检验应用

在临床诊断与治疗过程中，常会通过实验方式对各种微生物标本进行检验，从而为医师临床疾病判断和治疗方案制定提供重要依据。临床医务人员事先做好标本采集工作，通过规范采集提高标本准确性，不会对临床微生物预测分析造成直接影响。临床医生与检验人员必须遵循医院标本采集规范，在微生物检验和预测分析过程中重视临床沟通。医生在临床工作过程中通常都以微生物检验报告为主，护理人员需要将检验单交给患者家属，并对样本采集注意事项进行补充说明。真菌、病毒与细菌等是临床微生物检验常见物，荧光定量聚合酶链式反应技术在这些微生物检验中具有广泛应用空间。在临床真菌检验工作开展方面，检验人员可以通过荧光定量聚合酶链式反应技术检测样本，临床结果显示出来的特异度能够达到100%，技术检验结果精确性很高。在病毒检验方面，临床微生物检验人员可以选择各种类型样本为研究对象，通过荧光定量PCR技术检测出各种混合基因型[2]。比如在手足口病疾病临床诊断过程中，医师可以通过荧光定量聚合酶链式反应技术快速检测出来，这对临床医师预测、评估患者病情具有重要意义。检验人员可以使用荧光定量聚合酶链式反应技术将细菌中包含的各种类型基因检测出来，且临床检验特异性与灵敏度都很高，能够有效提升临床检验效果与工作效率。

2.2  乳品微生物检测应用

益生菌是乳品微生物中的一部分，摄入足量益生菌微生物能够促进宿主健康成长。以生物數量关乎宿主生命健康，可以通过货架期内产品保持宿主肠内以生物存活量。在益生菌产品使用方面，首先需要对产品安全质量进行检测。在乳品微生物检测方面，可以通过荧光定量聚合酶链式反应技术降低检验成本，缩短益生菌鉴定时间。在定量市售产品益生菌含量测定方面，是呀人员需要合理设置引物进行实时荧光定量聚合链式反应技术检测，这种检测方式能够获得较好灵敏度，其在酸奶制品检测方面具有一定应用价值。国外有学者将荧光定量聚合酶链式反应技术和核酸染料融合形成一种新的检测技术，能够将活性双歧杆菌与乳酸菌区分开来，对两种生物菌数量进行数据统计。相对于平板计数统计而言，这种荧光定量PCR技术用时更短，能够将检测时间缩短到3小时。在发酵乳制品检验方面，荧光定量聚合酶链式反应技术能够对乳制品原有乳酸菌种类进行检测，并确定各种菌群规模量。在成品干酪制作方面，有益微生物能够对这种产品风味产生直接影响。干酪产品可能会因为选择媒介缺乏而无法量化表面细菌。在涂抹型干酪检测过程中，检验人员可以通过荧光定量聚合酶链式反应技术检测出产品棒状杆菌功能与生态系统。

2.3  食源性致病菌检测

传统的食源性致病菌检测方案包括菌分离培养、生化鉴定等多个步骤，不仅时间耗费较长，且检测结果准确性存在一定的缺陷。目前生物学诊断方法被广泛用户食源性疾病的快速检测当中，其快速、高效的特征也明显改进了传统方案的缺陷。具体来看，微生物快速检测分析以快速精准的致病菌监测方案为基础，可以对食品中毒的不同特异性基因作为检测食源性致病菌的标靶基因。有研究针对南美白对虾的食源性致病菌进行了检测，通过DNA提取、多重实时荧光PCR技术，成功地进行了检测。结果表明，无论是人工接种还是自然污染的生虾样品当中都检测出了食源性致病菌。在目前的食源性致病菌检测工作当中，考虑到某些食品的背景菌群可能会在一定程度上影响检测结果的准确性，因此在检测环节可以视情况增加一个灭菌步骤，除去实验样品中的背景菌群。而多重实时荧光PCR方法并不会受到背景微生物群的严重干扰，在特异性与扩增效率上都能保持较高的水平，其特异性的优势也能确保该方案可以适用于不同食品基质中的致病菌检测。需要注意的是某些研究中需要利用PCR之前的增菌过程来更好地促进反应灵敏度的提升，但考虑到这一过程需要耗费数个小时以上的时间，对于试验效率会产生一定的不利影响。

3  结语

荧光定量聚合酶链式反应技术在乳制品微生物与临床微生物检验、判断等方面具有较高应用价值。在预测微生物学荧光定量聚合酶链式反应技术运用过程中，需要对以往缺陷进行改进，选择符合实际需求的样品，通过现代科学技术将检验结果显示出来。在微生物检验方法应用方面，要不断探索荧光定量聚合酶链式反应技术应用模型，通过预测模型优化、创新提高微生物检验效果，避免微生物生产应用出现安全问题。

参考文献：

[1] 朱军伟，杭锋，王钦博，等.实时荧光定量PCR技术在乳品     微生物学中的应用研究进展[J].安徽农业科学，2014（15）.

[2] 王宇，靳伟东，兰凯，等.荧光定量PCR技术在临床微生物     检测中的应用[J].中国卫生标准管理，2015（30））.