分级醇沉对罗勒多糖体外抑菌及免疫活性的影响

王 萍，贾晓顺，朱庆均，张颖颖

(1山东中医药大学药学院，济南 250355；2山东中医药大学中医学院，济南 250355)

罗勒具有疏风解表、强心安神、散瘀止痛、行气活血、解毒消肿等功效，临床用于治疗感冒咳嗽、头痛发热、月经不调等[1-7]。课题组多年来以罗勒多糖为主要研究对象，发现罗勒多糖具有较好的抗肿瘤[8-10]和抗菌效果[11]。在此基础上，课题组提取了罗勒粗多糖，再分级醇沉得到30%、50%、80%醇沉多糖，并对其体外抗菌及免疫活性进行了初步检测。结果显示，不同浓度的醇沉罗勒多糖的体外抗菌及免疫活性有显著差异。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1材料与试剂 罗勒，山东中鲁医院，经山东中鲁医院药剂科鉴定，为唇形科植物罗勒的干燥全草；无水乙醇、丙酮、氯仿、正丁醇，天津市富宇精细化工有限公司；胰蛋白酶，上海如吉生物科技发展有限公司，170512；苯酚，上海化工有限公司；浓硫酸，莱阳经济技术开发区精细化工厂；葡萄糖，AR，105℃干燥至恒重；营养琼脂，杭州百思生物公司，20160325001；MH(B)肉汤，杭州百思生物公司，20150922001等。

1.1.2仪器与设备 HH-2数显恒温水浴锅，上海邦西仪器科技有限公司；SHB-IIIA循环水式多用真空泵，上海沪析；RE-52AA旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；721G紫外可见分光光度计，上海精科仪器有限公司；DF-101S磁力搅拌器，上海邦西仪器科技有限公司；冷冻干燥机，北京博医康实验仪器有限公司；TD5Z平板离心机，上海颜麒生物科技有限公司；QQ-80B-III二氧化碳培养箱，上海启前电子科技有限公司等。

1.1.3菌株及细胞株 藤黄微球菌ATCC10240、表皮葡萄球菌ATCC12228、普通变形杆菌ATCC49027、肺炎克雷伯菌ATCC13882、铜绿假单胞菌ATCC27853及临床分离MRSA，均由山东中医药大学微生物教研室提供。RAW264.7巨噬细胞，由山东中医药大学微生物教研室保存，经复苏培养至状态稳定后备用。

1.2 方法

1.2.1罗勒多糖的制备

(1)罗勒多糖的提取：将罗勒药材经80%乙醇浸泡后充分干燥。取干燥后罗勒药材200g，加水2L，回流提取3次，每次1.5h，分次收集滤液，滤液减压浓缩至相对密度为 1.06。加无水乙醇调整乙醇浓度至80%，4℃静置24h，离心，沉淀用无水乙醇、丙酮依次洗涤，冷冻真空干燥，得罗勒粗多糖。将罗勒粗多糖加蒸馏水充分溶解后，再进行2次醇沉，得3次醇沉多糖。参照文献[12]，用Sevage法去除蛋白，最终得到去蛋白精制多糖。

(2)罗勒多糖分级醇沉：将去蛋白精制罗勒多糖加入25倍量蒸馏水使其充分溶解，加入无水乙醇，使醇浓度为30%，4℃静置24h，离心，沉淀依次用无水乙醇、丙酮洗涤，真空冷冻干燥得到30%醇沉多糖。同法分别制备50%、80%醇沉多糖。将醇沉多糖干燥后称重，收率分别为40.3%、27.3%、24.26%。用苯酚硫酸法[13]测得30%、50%、80%醇沉多糖含量分别为27.50%、36.78%、19.11%。

1.2.2体外抗菌实验

(1)细菌培养基制备及菌种活化：营养琼脂和MH(B)肉汤均按说明书要求高压灭菌，营养琼脂制作平板，MH(B)肉汤灭菌分装后4℃保存备用。将待检测各菌接种于营养琼脂表面，37℃培养24h，以无菌生理盐水洗脱菌苔制备菌液，比浊法调整浓度为1×106cfu/mL。(2)MIC及MBC测定：将各醇沉多糖配制为25mg/mL浓度，0.22μm无菌过滤器过滤后备用。待检测抑菌实验步骤参照NCCLS标准[14]，采用微量稀释法进行。按文献进行稀释[11]，得到2～64倍药物稀释度。同时设立庆大霉素孔为阳性对照，阴性对照孔仅加入菌液和培养液。加样完毕后加入对应菌液，每个药物重复3孔，37℃培养24h，以酶标仪对培养板在630 nm波长下测定 OD值，结合细菌生长情况判断结果。从上述各MIC孔中，吸取10μL液体，无菌操作均匀涂布于营养

琼脂平板上，以37℃ 24h后无明显生长现象的浓度作为最低杀菌浓度(MBC)[15]。

1.2.3体外免疫活性检测

(1)脾脏细胞增殖试验：采用MTT法进行检测。依文献方法制备小鼠脾脏细胞悬液[16]，调整其浓度为1.0×106个/mL备用。按照表1分组进行药物干预。取按上述步骤制备得到的脾脏淋巴细胞加入96孔培养板，调节细胞浓度为1.0×105个/mL，每孔100μL细胞，并加入1 640培养液(10%FBS、1%青链霉素)的调整药物浓度(表2)，空白对照组加入同体积的RPMI-1640培养液，培养体系最终体积为200μL。置37℃、5%CO2培养箱内孵育44h，加入20μL MTT(5g/L)，继续培养4h，平板离心机离心2 000r/min 10min，弃上清液，每孔加入150μL DMSO，37℃振荡10min，于酶标仪492nm处测定OD值。

(2)巨噬细胞增殖试验：RAW264.7巨噬细胞以RPMI-1640培养液(含10%FBS、1%青链霉素)进行培养，待其状态稳定后备用。在96孔板中，每孔加入1×105的RAW264.7细胞，以上述RPMI-1640培养液调整药物浓度(表3)，最终体积为每孔200μL，每个浓度设置3个重复孔。同时设立空白对照，只加入PBS和RPMI-1640培养液(含10%FBS、1%青链霉素)。在37℃、5%CO2条件下培养44h后，加入20μL 5mg/mL MTT，继续培养4h，随后吸弃上清，每孔加入DMSO 150μL，37℃震荡10min，以492 nm测定OD值。

3 结果与分析

3.1 抑菌试验

表1显示，除铜绿假单胞菌外，不同浓度的醇沉罗勒多糖均有一定的抑菌效果，其MIC在1.56～12.5mg/mL之间。各检测菌中，罗勒多糖对藤黄微球菌ATCC10240和普通变形杆菌ATCC49027的抑菌效果最为显著，30%醇沉罗勒多糖MIC为1.56mg/mL；各浓度醇沉多糖中，30%醇沉多糖显示了较好的抑菌活性，对藤黄微球菌ATCC10240、粪肠球菌ATCC29212、表皮葡萄球菌ATCC12228和普通变形杆菌ATCC49027的抑制作用均强于其他浓度的醇沉罗勒多糖，50%醇沉罗勒多糖的抑菌活性又高于80%醇沉罗勒多糖。总体分析显示，各浓度醇沉罗勒多糖对藤黄微球菌ATCC10240和普通变形杆菌ATCC49027的抑制效果最好，30%醇沉多糖的抑菌活性最强，80%醇沉罗勒多糖最弱。结果还表明，不同浓度的醇沉罗勒多糖对各菌株均无明显的MBC，说明罗勒多糖不能杀死上述各菌，仅抑制其生长，故未测得MBC。

表1 不同浓度醇沉罗勒多糖MIC/MBC

注：“-”未测得明显的MIC或MBC

3.2 脾脏细胞增殖试验

由表2可见，不同浓度的醇沉罗勒多糖对小鼠脾脏细胞均有一定的刺激作用。最佳刺激浓度30%醇沉罗勒多糖为1mg/mL，50%醇沉罗勒多糖为0.25mg/mL，而80%醇沉罗勒多糖为0.125mg/mL。其中，50%醇沉罗勒多糖在0.063～0.5mg/mL浓度之间OD值均高于其他各组，显示其在低浓度下依然具有较好促进脾脏细胞增殖的作用。

表2 不同浓度醇沉罗勒多糖脾脏细胞培养结果

注：*与空白对照相比，P<0.05；* *与空白对照相比，P<0.01；△与30%醇沉罗勒多糖相比，P<0.05；▲与80%醇沉罗勒多糖相比，P<0.05

3.3 脾脏细胞增殖试验

表3结果说明，不同浓度的醇沉罗勒多糖对小鼠巨噬细胞均有一定的刺激作用。最佳刺激浓度均为1mg/mL。其中，30%醇沉罗勒多糖在0.063～0.5mg/mL浓度下OD值均高于其他各组，在此浓度范围内对小鼠巨噬细胞的增殖具有最好的刺激作用。

4 讨论

多糖是植物的主要活性成分之一[17]，水提分级醇沉是研究多糖的常用方法[18]。研究显示，不同分子量的多糖具有不同的生物活性[19]。据文献报道，罗勒多糖具有抗肿瘤[20-22]、抗菌[11]等多方面功效，是罗勒的主要有效成分之一。

表3 不同浓度醇沉罗勒多糖巨噬细胞培养结果

注：*与空白对照相比，P<0.05；* *与空白对照相比，P<0.01；△与30%醇沉罗勒多糖相比，P<0.05；▲与80%醇沉罗勒多糖相比，P<0.05

课题组前期研究已经发现，水提醇沉是提取罗勒多糖的有效方法[23]。本文对不同浓度分级醇沉罗勒多糖的抑菌活性、刺激免疫细胞增殖能力进行了对比研究，发现30%醇沉多糖抑菌效果最佳，50%醇沉多糖促进脾脏细胞增殖作用最为显著，而30%醇沉多糖对巨噬细胞增殖的刺激作用最强。不同浓度的醇沉罗勒多糖作用效果有显著差异，说明不同分子量的罗勒多糖具有不同的生物活性。据此推测，罗勒多糖中的大分子成分可能具有相对较好的抑菌活性，对巨噬细胞的增殖也有较好的促进；但在刺激脾脏细胞方面，罗勒多糖所含中等大小成分可能有更好的效果。

罗勒的食用价值较高，已被广泛应用于食品生产。本研究显示，不同浓度的醇沉罗勒多糖均有较好的抑菌和免疫调节活性。在此基础上，课题组将进一步提取纯化罗勒多糖，以期明确其不同成分的具体作用，深入探究罗勒多糖的食用价值及药用价值，进而改进食品生产工艺，为开发新型功能食品提供更多科学依据。◇