低频相关常染色体显性遗传耳聋家系的临床与遗传学特征分析

吴侃 王洪阳 杨驹 赵翠 兰兰 王大勇 关静 王秋菊

解放军总医院耳鼻咽喉头颈外科解放军耳鼻咽喉研究所(北京100853)

耳聋是人类最常见的感觉功能障碍性疾病，大约三分之二的耳聋与遗传因素相关[1]。遗传性耳聋有着显著的遗传异质性和表型多样性，同一基因的变异可以引起多种表型的耳聋，而一种耳聋表型也可以由多种基因变异引起。遗传性耳聋的表型和基因型之间存在一定的因果联系，可将表型特征作为定位基因的线索之一。因此，表型特征的分析在耳聋家系的研究中起着至关重要的作用。本研究对一个以低频下降起病的耳聋家系进行了临床资料总结、听力学及遗传学特征的分析，为下一步基因鉴定、遗传咨询、婚育指导奠定了基础。

1 资料与方法

1.1 家系资料的采集

本研究通过了解放军总医院伦理委员会的伦理论证。本研究中耳聋家系位于福建省某县，为一个4代相传的耳聋家系（1507327家系）。先证者为1名52岁的女性因双耳渐进性听力下降，于2015年3月就诊于中国人民解放军总医院耳鼻咽喉头颈外科，在门诊进行详细的病史采集、听力学及影像学检查，检查包括：纯音测听、声导抗、言语识别率、畸变产物耳声发射（DPOAE）、听性脑干反应（ABR）、颈部血管超声、颞骨CT、内听道水成像等，2017年8月于门诊行听力复查。家系采集小组赴当地应用问卷调查表对签署知情同意书的51名家系成员进行了一般情况、现病史、既往史及家族史等信息的采集；应用电耳镜检查耳道及鼓膜情况；并进行了纯音测听、声导抗等听力学检查。抽取50名家系成员外周静脉血样本10~20ml用于基因组DNA的提取和保存。

1.2 临床听力学检测

先证者听力学检测在标准隔声室进行：应用Madsen Conera诊断型听力计（丹麦），TDH-39头戴式气导耳机（丹麦），B-71骨导式耳机（丹麦）对先证者进行纯音测听检查；应用上海瑞金医院编制的音素平衡50单音节词表，由解放军总医院自行录制合成的词表CD，对先证者进行言语识别率测试；应用Madsen Capella全功能耳声发射仪（丹麦），10DPOAE Probe插入式耳机对先证者进行DPOAE检查；应用HIS 4368 Smart EP（美国）测试仪对先证者进行ABR测试。家系其他成员听力学检查由家系采集小组赴当地采集：应用Madsen 502便携式听力计（丹麦），TDH-39头戴式气导耳机（丹麦），B-71骨导式耳机（丹麦）对家系成员进行纯音测听检查；应用Madsen OTO flex100声导抗检测仪（丹麦）检测鼓室图及镫骨肌反射。以上仪器均定时按国际标准进行校准。

1.3 耳聋表型的分类及判断标准

根据是否有全身其他系统器官的受累，将遗传性耳聋分为综合征型耳聋与非综合征型耳聋；（2）根据语言发育阶段分为语前聋与语后聋；（3）根据听力损失性质分为传导性耳聋、感音神经性耳聋、混合性耳聋；（4）根据NIH&WHO 2000年标准[2,3]，耳聋表型根据听力损失的频率分为:：高频听力损失型；低频听力损失型；覆盆(中间)听力损失型；全频听力损失型；（5）根据美国言语语言听力协会（ASHA）1981年的听力损失分级方法[4]，将听力较好耳的语言频率平均阈值分为6个听力损失等级：正常≤25dB；轻度：26～40dB；中度：41～55dB；中重度：56～70dB；重度：71～90dB；极重度≥91dB。

1.4 遗传性耳聋遗传方式分析

目前国际上公认的非综合征型耳聋遗传方式有以下几种：常染色体显性遗传方式占15~20%，常染色体隐性遗传占80%，性染色体-连锁遗传方式约占1%[5]。每一种遗传方式的非综合征型耳聋均具有独特的遗传学特征。本研究对家系的遗传特征按照上述不同遗传方式的特点进行了遗传学分析。

1.5 统计学分析

数据采用SPSS 20统计软件进行统计分析。年龄与较好耳平均听阈的关系采用直线回归分析。设年龄为自变量X，较好耳平均听阈值为因变量Y，采用t检验，P<0.05有显著性差异。

2 结果

2.1 11507327家系资料

该家系位于福建省，共4代，现存家系成员99人，最年长者74岁（Ⅱ:12），最年幼者6岁（Ⅳ:45）。共调查51名家系成员（含先证者），有听力损失者共20人（见图1）。其中15名家系直系亲属为感音神经性耳聋，2人为传导性耳聋（Ⅲ:6，Ⅲ:40），1人为混合性耳聋（Ⅲ:24），另有2名家系配偶为感音神经性耳聋（Ⅲ:10、Ⅲ:25）。15名感音神经性耳聋患者无噪声及耳毒性药物接触史，12名患者伴有耳鸣，无患者伴发眩晕，家系听力损失患者体检未发现其他系统异常。传导性耳聋及混合性耳聋患者（Ⅲ:6，Ⅲ:40，Ⅲ:24）均有慢性化脓性中耳炎病史。

2.2 1507327家系耳聋表型特征

2.2.1 临床听力学特征

该家系15名感音神经性耳聋患者年龄最大者74岁，年龄最小者23岁。自诉发病年龄从8岁到49岁不等，平均发病年龄31.7岁，为迟发型语后聋。听力图曲线呈低频听力损失型4例，全频听力损失型11例。听力损失程度从轻度到极重度不等，轻度2例，中度4例，中重度3例，重度5例，极重度1例（见表1）。

表1 1507327家系患者听力表型总结Table 1 Summary of clinical data for affected members in family 1507327

先证者（Ⅲ:44）2015年2月检查：平均听阈左耳75dB HL，右耳55dB HL；言语识别率左耳28%，右耳32%；ABR测试100dB nHL刺激声下双耳仅见Ⅴ波，波形严重异常；DPOAE左耳未引出，右耳4kHz引出，其余频率未引出；颈部血管超声双侧均未见异常；颞骨CT及内听道水成像未发现中耳及内耳畸形，未见占位性病变，但提示左侧乳突炎。2017年8月复查：平均听阈耳70 dB HL，右耳71.25dB HL。

2.2.2 听阈与年龄关系

分析15例感音神经性耳聋患者的听力损失程度，发现随着年龄的增加，各代患者平均听力损失程度逐渐加重，由轻度发展至极重度，低频（125～500Hz）听力损失也逐渐加重至重度。将年龄作为自变量X，将较好耳平均听阈作为因变量Y，做线性回归分析可见，患者的平均听阈与年龄呈正相关，有统计学差异（P=0.001），可用线性回归方程y=1.180x+4.886（R²=0.618）预测听力损失程度与年龄的变化关系（见图2、表2）。先证者时隔2年听力复查结果显示左耳平均听阈无明显变化，右耳平均听阈有16.25dB HL的下降。

2.2.3 1507327家系遗传学特征分析

应用Cyrillic 2.1软件根据家系调查和听力检查结果绘制系谱图（见图1）。通过对1507327家系的系谱图分析可知：1507327家系共4代，各代连续发病，每一代男女均可患病，在进行过听力测试的家系成员中，Ⅱ代患病率100%（1/1），Ⅲ代患病率61.11%（11/18），Ⅳ代患病率13.04%（3/23）（见表3）。该家系每一代的耳聋平均发病年龄在27～35岁之间（见表1），Ⅱ代平均发病年龄35岁，Ⅲ代32.45岁，Ⅳ代27.67岁。由此可见，1507327家系符合典型常染色体显性遗传特点：（1）连续三代以上发病；（2）男女发病机会均等；（3）患者的双亲中必有一方为患者，患者的同胞中近半数患病；（4）双亲都正常时，子女听力均正常；（5）男女患者均可将耳聋表型传递给后代。

图1 1507327家系-常染色体显性遗传性耳聋系谱图Fig.1 Pedigree of the family 1507327

图2 1507327（A）家系患者-典型听力曲线；（B）家系内不同患者听力较好耳平均听阈和年龄的趋势散点图，n=15，P=0.001，有统计学意义。（C）先证者2015年与2017年的气导听力变化Fig.2 (A)Typical hearing curve of affected family members,(B)Scatterplot of the average threshold in different patients’better ears along with the age,n=15，P=0.001，Statistically significant.(C)Comparison of air conduction hearing of proband in 2015 and 2017.

表2 1507327家系每一代患者听阈与年龄关系Table 2 The relationship between auditory threshold and age of patients in each generation in family 1507327

3 讨论

遗传性耳聋具有高度的遗传异质性，而耳聋基因与耳聋表型之间又存在一定的因果联系。基因型是表型的遗传学物质基础，而表型又因为环境等因素的影响具有多样性。本研究中的耳聋家系图谱分析表现为常染色体显性的遗传模式，具有迟发型、语后聋、渐进性等常见的非综合征常染色体显性耳聋（autosomal dominant non-syndromic sensorineural hearing loss,ADNSHL）家系特征，也表现出一些独有的表型特点。首先，发病年龄从8岁到49岁，除一名患者（Ⅲ:11）8岁发病，均为20岁以上发病，平均发病年龄31.7岁，发病年龄有逐代提前的趋势，同时外显率逐代降低。其次，以轻度低频听力损失起病，逐渐累及中高频；对家系内不同患者年龄及听力损失程度进行线性回归分析提示：较好耳听力损失每年增加约1.1801dB HL，并在60岁以上的家系成员中出现极重度和全聋。先证者2年内右耳平均听阈降低幅度超过回归方程的预测，可能与个体差异、环境、测试状态、测量误差等因素有关。

已知的ADNSHL相关基因大多导致高频性听力损失[6]，只有少数基因变异引起低频感音神经性听力损失（low frequency sensorineural hearing loss，LFSNHL），这些基因包括：DIAPH1（DFNA1）、WFS1（DFNA6/14/38）、CCDC5D（DFNA44）、TNC（DF⁃NA56）[7-12]。其中，WFS1基因突变引起LFNSHL的报道较多[13-18]，在人群中较为常见，在日本一项研究中有2.5%（15/602）的ADNSHL家庭检出了该基因的变异[19]。WFS1导致的耳聋听力损失较轻，局限于低频，较为稳定[8,20]，这与本研究家系表型特征有较大的差别。另外三种基因所致的耳聋都表现为低频蔓延至全频，听力损失程度逐渐发展的渐进性语后聋[7,11,12]，在发病年龄，听力损失程度，伴发症状上各自存在一些差别：如DIAPH1发病年龄在10岁左右[7]；CCDC5D为6-10岁[11]；TNC发病年龄为8-30岁[12]；CCDC5D以中度听力损失起病[11]；DIAPH1可伴有血液学的异常，表现为巨血小板减少症（mac⁃rothrombocytopenia，MTP）[21-23]。本研究家系可以完善血液学检查以帮助致病基因的鉴定。其他一些低频相关性的ADNSHL，如DFNA31、DFNA 49、DF⁃NA 54、DFNA 57仍未找到相应的致病基因[24-27]。

另外，听神经病作为一种特殊的感音神经性耳聋也可表现为低频听力损失，但需要满足[28]：（1）毛细胞的功能正常，即耳声发射（OAE）和/或耳蜗微音器电位（CM）可引出；（2）听神经功能异常，即听性脑干反应（ABR）异常或全部消失；（3）同时多可伴有中枢或周围神经病变。该家系先证者（Ⅲ:44）ABR严重异常，DPOAE右侧4kHz可引出，言语识别率差，影像学检查显示左侧中耳炎症，不排除由于左侧中耳炎症干扰导致左侧DPOAE幅值降低或引不出，因此尚不能排除听神经病的可能性。可对先证者完善耳蜗微音器电位检查以检测外毛细胞功能。其他家系患者也可增加ABR潜伏期、ABR阈值、DPOAE、耳蜗电图、言语识别率、颞骨CT等检查，以排除或确定听神经病。目前至少发现17个听神经病相关基因，包括OTOF、PJVK、DIAPH3、AIFM1、PMP22、MPZ、NF-L、NDRG1、GJB1、GJB3、OPA1、TMEM126A、TIMM8A、WFS1、FXN及线粒体基因突变12S rRNA（T1095C）、MTND4（11778mtD⁃NA）[29]，其中只有DIAPH3[30]引起的听神经病呈现常染色体显性遗传模式。

综上所述DIAPH1、CCDC5D、TNC、DIAPH3等耳聋基因可作为候选基因进行Sanger验证。经典的耳聋基因研究常采用候选基因或连锁分析位置候选基因法，但它们耗时、费用高、有时难以发现致病基因。耳聋基因Panel测序或全外显子组测序（whole exome sequencing，WES）等新一代测序技术（next-generation sequencing technology,NGS），其具有经济、精确、可行、周转时间短等优势[31]。对于非编码区特殊位点的突变和基因组大片段的缺失或插入（insertion and deletion，InDel），以及拷贝数的变化（copy number variation，CNV）等涉及到基因组结构的变异（SV）则可应用微阵列比较基因组杂交技术(array based comparative genomic hybridization，aCGH)及全基因组重测序（whole genome sequenc⁃ing）来扩大搜索范围。

总之，在耳聋家系研究中，我们应该珍惜我国丰富的耳聋家系资源，综合运用多种基因分析策略，力求科学、高效、经济地得到耳聋基因信息。本研究也将为今后遗传性耳聋家系候选基因的筛选思路提供参考，也有助于低频相关性耳聋的遗传咨询和诊断分析。

表3 1507327家系患者每代患病率Table 3 Prevalence per generation in family 1507327