阿帕替尼联合放疗对HeLa细胞Ki－67表达的影响及与生长抑制相关性研究

彭红菊，刘 伟，张建文 ，岳宏程，傅少志

（西南医科大学附属医院肿瘤科，四川 泸州 646000）

宫颈癌（cervical cancer）是女性常见恶性肿瘤，发展中国家发病率高[1]，2009和2010年位居中国肿瘤的第10 位[2－3]。阿帕替尼（apatinib）为新一代口服抗血管生成药物，在胃癌、肺癌、肝癌、乳腺癌等多种肿瘤中均具有良好的抗肿瘤作用[4－7]，但与放射治疗（简称放疗）联合应用的报道较少。本研究中探讨阿帕替尼联合放疗治疗宫颈癌对Ki－67阳性表达率的抑制作用，以及Ki－67阳性表达率变化与肿瘤生长抑制率的关系。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 细胞、动物、仪器与试药

细胞、动物：对数生长的HeLa细胞株（西南医科大学附属医院）；健康 BALB／c－nu雌性裸小鼠（4～5周龄、体质量18～20 g，重庆腾鑫华阜生物科技公司，动物许可证编号为SCXK＜京＞2014－0004，SPF级饲养）。

仪器：直线加速器（Elekta）；石蜡切片机（德国莱卡仪器有限公司）；新型BGZ系列Ⅱ型高精度烤箱（上海博讯实业有限公司）；移液器（德国艾本德公司）；倒置相差显微镜（日本奥林巴斯公司）。

试药：甲磺酸阿帕替尼片[江苏恒瑞医药股份有限公司，国药准字H20140103，规格按阿帕替尼（C24H23N5O）计每片 250 mg]，化学名称为 N －[4－（1－氰基环戊基）苯基]－2－（4－吡啶甲基）氨基 －3－吡啶甲酰胺甲磺酸盐，分子式为C24H23N5O·CH4SO3，相对分子质量为493.58。DMEM高糖完全培养基（美国Hyclone公司，胎牛血清∶双抗∶DMEM培养基体积比为10∶1∶90，配制成 10%的完全培养基）；10%胎牛血清（美国 Hyclone公司）；0.25%胰酶（上海碧云天公司）；青霉素－链霉素抗体（上海碧云天公司）；Ki－67抗体（美国 BioWorld 公司）；DMSO（美国 Sigma公司）。

1.2 方法

荷瘤小鼠模型建立及分组：取HeLa细胞株，接种于小鼠右后肢根部皮下，观察记录裸鼠一般状态、体质量、成瘤情况及瘤体积变化。待肿瘤体积达到 100～150 mm3时，荷瘤鼠随机分为 3组，每组12只。对照组予生理盐水0.1 mL／d灌胃第1天至第7天；单纯放疗组（放疗组）连续观察 7 d，第 7天开始放疗（Dt＝8 Gy／F×1次×1 d）；阿帕替尼联合放疗组（联合组）将配制好的阿帕替尼溶液（质量浓度为40 g／L），每只裸鼠按200 mg ／（kg·d）剂量给予灌胃，连续灌胃 7 d，第 7 天灌胃完成后 2 h 行放疗（Dt＝ 8Gy／F×1次 ×1 d）。于实验完成后第2天各组处死6只，采集肿瘤标本，用于Ki－67检测，余6只用于观察肿瘤体积变化。

阿帕替尼溶液配制：取阿帕替尼片（规格为每片250 mg），按40 mg阿帕替尼 ∶1 mL 0.9%氯化钠注射液比例配制成质量浓度为40 g／L的阿帕替尼灌胃液，于开始灌胃前30 min配制备用。

Ki－67表达检测：采用免疫组化SP法检测，细胞胞核染色呈棕黄色或褐色判为阳性。随机选取各组肿瘤组织切片中高倍镜下5个视野，并计数Ki－67阳性细胞个数，计算5个视野下阳性细胞数占总细胞数的比例即为Ki－67阳性表达率。

肿瘤体积和肿瘤生长抑制率计算：各组于实验结束后第1天开始，每隔2 d测量各组移植瘤最大直径（A，mm）与最小直径（B，mm），直至第 25天。计算各组肿瘤体积（TV）平均值，作为各组最终用于评价TV，根据最终TV 计算肿瘤生长抑制率（TGIR），TV＝ A×B／2；TGIR＝（TV对照组－单纯放疗组 ／TV联合组）／TV对照组×100%。

1.3 统计学处理

采用SPSS 17.0统计软件分析。计量数据以均数±标准差（±s）表示，行独立样本 t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Ki－67 阳性表达率

联合组Ki－67阳性表达率低于15%，放疗组高于60%，分别比对照组降低 84.49%和 28.06%；联合组Ki－67阳性表达率比放疗组降低78.44%，差异有统计学意义（P ＜0.05）。详见表 1和图 1。

表1 各组 Ki－67表达情况比较（±s，n＝6）

表1 各组 Ki－67表达情况比较（±s，n＝6）

注: 为与对照组比较， 为与放疗组比较。下表同。

P1值 ／t1值P2值 ／t2值组别对照组放疗组联合组阳性表达率（±s，%）92.83 ± 4.04 66.78 ± 5.01 14.40 ± 2.72 0.00 ／7.01 0.00 ／16.810.00 ／15.91

图1 肿瘤Ki－67表达情况（×400）

2.2 肿瘤体积和TGIR

联合组肿瘤体积最小，对照组最大，差异有统计学意义（P＜0.05）。联合组和放疗组肿瘤体积分别比对照组缩小52.55%和32.64%，联合组比放疗组缩小29.56%。联合组TGIR最高，比放疗组高22.17%。详见表2。

3 讨论

Ki－67是反映肿瘤细胞增殖活性的指标，在脑膜瘤、结直肠癌、乳腺癌、膀胱癌、宫颈癌等多种肿瘤中均有不同程度表达[8－12]。世界卫生组织（WHO）Ⅱ级脑膜瘤中，Ki－67的平均表达值为 13% （1% ～47% ）[8]。结直肠癌中，Ki－67表达阳性表达率≥20%[9]。组织学检测宫颈上皮内瘤变1，2，3级Ki－67阳性表达率分别为2.13% ，19.93% 和 23.22% ，宫颈癌中 Ki－ 67 阳性表达率为 69.72% ～ 75.0%[12－13]。提示宫颈癌是具有高度增殖活性的肿瘤。本研究中，宫颈癌HeLa细胞Ki－67阳性表达率为（92.83 ±4.04）% ，高于文献[12 －13]报道，预示宫颈癌HeLa细胞是具有高增殖活性。

肿瘤组织中Ki－67阳性表达率高低与预后有相关性。WHOⅡ级脑膜瘤术后放疗与Ki－67表达研究显示，局部复发患者Ki－67平均表达值为15%，无复发患者 Ki－67平均表达值为12%，Ki－67＞13%显著影响局部控制率[8]。三阴乳腺癌新辅助化疗，病理完全缓解和无效的Ki－67表达显著截止值为20%[14]。结直肠癌中Ki－67表达与TNM分期密切相关，TNM分期越高，Ki－67表达越高，Ki－67高表达的5年无复发生存率为 53%，Ki－67低表达为 89%[9]。宫颈癌 Ki－67阳性表达中位总生存期55个月，阴性表达60个月，局部控制率分别为 80.7%和 89.2%[15]。因此，宫颈癌 Ki－67阳性表达对生存期和局部控制率均有影响。

降低肿瘤组织中Ki－67表达水平，有可能改善患者预后。宫颈癌研究中，卡铂＋紫杉醇联合化疗，可使Ki－67阳性表达率由化疗前的76.00%降至化疗后的20.00%[16]。本研究结果提示，宫颈癌单纯放疗对Ki－67阳性表达率抑制非常有限，在放疗基础上联合阿帕替尼可明显抑制Ki－67阳性表达率，预示阿帕替尼联合放疗能明显抑制宫颈癌HeLa细胞增殖活性。

肿瘤体积越大，负荷越大，肿瘤生长越快，肿瘤生长抑制率越低，无论是化疗、手术治疗，还是放疗，首要结果是降低肿瘤负荷，提高肿瘤生长抑制率。因此，肿瘤生长抑制情况与抗肿瘤治疗相关[17]，紫杉醇、他莫昔芬等与肿瘤生长抑制研究较多相关[18－19]。本研究结果提示，阿帕替尼联合放疗能使宫颈癌HeLa细胞肿瘤体积明显缩小，效应远大于单纯放疗，肿瘤生长抑制率提高。宫颈癌阿帕替尼联合放疗可能存在明显协同作用。

综上所述，宫颈癌阿帕替尼联合放疗可明显抑制Ki－67阳性表达率，抑制宫颈癌HeLa细胞增殖活性，导致肿瘤体积缩小，提高肿瘤生长抑制，可能存在明显协同抗肿瘤作用，Ki－67阳性表达率降低是可能机制。建议Ki－67阳性表达率较高的宫颈癌患者临床使用。