雷公藤甲素对肿瘤坏死因子－ 介导的HCM心肌细胞生长损伤保护作用研究

林芸芸 ，宋艳玲 ，蔡海云，顾申红

（1.海南医学院第一附属医院，海南 海口 570000； 2.海南医学院第一临床学院，海南 海口 570000）

肿瘤坏死因子－α（TNF－α）是一种主要由巨噬细胞和单核细胞产生的促炎细胞因子，除参与正常炎性反应和免疫反应外[1]，还可作为独立因素参与心肌损伤[2]，也可作为损伤心肌细胞的诱导剂。雷公藤甲素（TW）是中药雷公藤的主要活性成分，具有抗炎、抗癌等多种药理作用[3－4]。本研究中通过体外实验研究了TW干预TNF－α对HCM心肌细胞的生长抑制和凋亡诱导作用。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

细胞：人心肌细胞HCM（美国模式培养物保藏中心，ATCC，批号为 BNCC337719）。

仪器：c150型 CO2细胞培养箱（德国Binde公司）；SW－CJ型超净工作台（苏州净化设备公司）；A10型超纯水仪（美国Millipore）；DMI8型倒置显微镜（德国莱卡公司）；MDF－C8V1型－80℃超低温冰箱（日本 Sanyo公司）；FC500MCL型流式细胞仪（美国Beckman公司）。

试药：高糖DMEM培养基（批号为10569010），胰蛋白酶（批号为25200056），乙二胺四乙酸（EDTA，批号为AM9260G），磷酸盐缓冲溶液（PBS，批号为 1001002），胎牛血清（FBS，批号为 10099141），均购于美国 Gibco公司；二甲亚砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO，批号为 D2650），TW（批号为 38748－32－2，HPLC法纯度 ＞98%），均购于美国Sigma公司；TNF－α（北京义翘神州生物科技有限公司，批号为10602－HNAE）；MTS细胞毒性检测试剂盒（美国 Promega公司，批号为 G3582）；Annexin V－FITC／PI凋亡测定试剂盒（美国Sigma－Aldrich公司，批号为APOAF－20TST）；肌酸激酶（CK）活性检测试剂盒（上海哈灵生物科技有限公司，批号为 HL70047，20T）；乳酸脱氢酶（LDH）活性检测试剂盒（上海哈灵生物科技有限公司，批号为HL20042，48T）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

人心肌细胞HCM为贴壁细胞，使用含有10%FBS、100 U／mL青霉素和100 g／L链霉素的高糖DMEM培养基培养，置5%CO2，37℃ 细胞培养箱中培养。待细胞生长至约90%时，弃去原培养基，用PBS轻轻吹吸1～2次，用0.25%胰蛋白酶消化，传代（平均2 d传代1次）。

1.2.2 四唑盐（MTT）比色法检测细胞生长抑制

TNF－α或 TW：将 HCM细胞用 0.25%胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液，按3×104个细胞／孔的密度均匀接种于96孔板。第2天待细胞贴壁生长后弃去培养基，用PBS洗去未贴壁细胞，加入新鲜培养基。实验组分别加入不同质量浓度（50，100，150，200，250，300 ng／mL）的 TNF －α 或不同质量浓度（1，3，10，30，50 ng／mL）的TW，对照组则加等量不含药物的培养液。继续培养24 h，弃去培养上清液，每孔加MTT 20 μL和不含血清培养基 100 μL，37 ℃孵育 0.5 ～1.0 h。最后用酶标仪在480 nm波长处检测各孔吸光度值，并计算细胞存活率。细胞存活率（%）＝1－[（实验组 A490－校零孔 A490）／（对照组 A490－校零孔 A490）]×100%。

TW 联合 TNF－α：将 HCM细胞用 0.25%胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液，按3×104个细胞／孔的密度均匀接种于96孔板。第2天待细胞贴壁生长后弃去培养基，用PBS洗去未贴壁细胞，加入新鲜培养基。处理组加入245 ng／mL的TNF－α进行处理，实验组分别加入不同质量浓度（3，10，30，50 ng／mL）的 TW。继续培养24 h，弃去培养上清液，每孔加MTT 20 μL和不含血清培养基 100 μL，37 ℃孵育 0.5 ～1.0 h。最后用酶标仪在480 nm波长处检测各孔吸光度值，并计算细胞存活率。

1.2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡

根据Annexin V－FITC／PI凋亡检测试剂盒说明书进行操作。将HCM细胞用0.25%胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液，按2×105个细胞／孔的密度均匀接种于6孔板。第2天待细胞贴壁生长后弃去培养基，用PBS洗去未贴壁细胞，加入新鲜培养基。处理组加入245 ng／mL的TNF－α进行处理，实验组分别加入不同质量浓度（3，10，30，50 ng／mL）的 TW。继续培养 24 h ，弃去培养上清液，胰酶消化、离心、收集细胞，用250 μL结合缓冲液重悬细胞并调整细胞浓度约为1×106个细胞／mL。向细胞悬液中依次加入Annexin V－FITC和PI溶液，混匀后室温避光孵育15 min，加入400 μL PBS，混匀后上流式细胞仪检测分析。

1.2.4 试剂盒检测细胞上清液中CK和LDH水平

将HCM细胞用0.25%胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液，按2×105个细胞／孔的密度均匀接种于6孔板。第2天待细胞贴壁生长后弃去培养基，用PBS洗去未贴壁细胞，加入新鲜培养基。处理组加入245 ng／mL TNF－α进行处理，实验组则分别加入不同质量浓度（3，10，30，50 ng／mL）的 TW。继续培养 24 h 后取细胞上清液，按照相关试剂盒说明书进行操作，检测细胞上清液中CK和LDH水平。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 TNF－ 或TW对细胞生长的抑制作用

MTT试验结果显示，与对照组相比，TNF－α可抑制 HCM细胞的生长，并呈浓度依赖性（P＜0.01）。TNF－α 的半数抑制浓度（IC50）经 Graphpad prism 5.0软件计算，确定为 245 ng／mL，详见图 1 A。经 1.0～10.0 ng／mL的TW作用24 h后，HCM细胞生长变化无明显差异，而＞30.0 ng／mL质量浓度的TW处理可明显抑制细胞生长（P＜0.01），详见图 1 B。

图1 TNF－ 或TW对HCM细胞生长的抑制作用（ P＜0.01）

2.2 TW联合TNF－ 对细胞生长的抑制作用

用245 ng／mL的TNF－α处理HCM细胞的同时，加入不同质量浓度的TW进行干预。24 h后MTT结果显示，3 ng／mL TW 和10 ng／mL TW 实验组的 HCM 细胞抑制率明显低于处理组（P ＜ 0.01），而 50 ng／mL TW实验组的 HCM细胞抑制率反而升高（P＜0.01），详见图2。

图2 TW联合TNF－ 对人心肌细胞生长的抑制作用（ P＜0.01）

2.3 TW对TNF－ 处理后细胞的凋亡诱导作用

用245 ng／mL的TNF－α处理HCM细胞的同时，加入不同质量浓度的TW进行干预。24 h后，流式结果显示，3 ng／mL TW 和 10 ng／mL TW 实验组对 HCM 细胞的凋亡诱导明显低于处理组（P ＜0.01），而 50 ng／mL TW实验组对HCM细胞的凋亡诱导反而增强（P＜0.01）。详见表1。

表1 TW对TNF－ 处理后人心肌细胞的凋亡诱导作用（±s，%）

表1 TW对TNF－ 处理后人心肌细胞的凋亡诱导作用（±s，%）

注：Q2为晚期凋亡细胞比例，Q3为早期凋亡细胞比例，Q2＋Q3为总的凋亡细胞比较。与处理组比较，aP＜0.01。

组别处理组TW 3 ng／mL 组TW 10 ng／mL 组TW 30 ng／mL 组TW 50 ng／mL 组Q2 28.9 ± 2.5 15.8 ± 1.1a 24.3 ± 3.2 26.7 ± 1.5 42.5 ± 1.5a Q3 6.4 ± 1.8 3.2 ± 0.4a 3.7 ± 2.1a 5.3 ± 2.1 10.3 ± 2.0a Q2＋Q3 35.3 ±2.3 19.0 ±1.0a 28.0 ±1.5a 32.0 ±1.7 52.8 ±4.0a P＜0.01＜0.01＜0.01

2.4 TW联合TNF－ 对CK和LDH水平的影响

与对照组相比，3 ng／mL TW 和 10 ng／mL TW 实验组中CK和LDH水平明显降低，差异有统计学意义（P ＜ 0.01）。而 30 ng／mL TW 和 50 ng／mL TW 实验组对CK和LDH的影响不明显。详见图3。

3 讨论

TNF－α是一种多功能细胞因子，在感染与炎性反应、肿瘤细胞生长的抑制中发挥重要作用，与造血、心、肝、肾、肌肉等系统功能及器官移植的排斥反应、败血症、恶病质、心力衰竭等都密切相关。有研究发现，TNF－α对心肌细胞有诱导凋亡作用，其激活及表达上调是导致心肌功能紊乱的重要因素。可能有以下途径：1）TNF－α通过与TNF－α受体结合，激活 JNK信号通路及下游转录因子，从而诱导心肌细胞凋亡[5－6]；2）TNF－α通过诱导一氧化氮的生成，与超氧阴离子结合，发挥毒性作用，引起氧化还原系统失衡，对心肌细胞发挥损伤作用[7]；3）TNF－α通过诱导与细胞凋亡密切相关的 c－los，c－jun，c－Myc等原癌基因表达，从而诱导心肌细胞凋亡[8]；4）TNF－α可通过鞘氨醇依赖机制诱导心肌细胞发生凋亡[9]。本研究结果显示，TNF－α处理后细胞生长受到明显抑制，细胞凋亡率明显增加，提示TNF－α有对人心肌细胞的损伤作用。

图3 TW联合TNF－ 对细胞上清液中CK和LDH 水平的影响（ P ＜0.01）

TW又称雷公藤内酯，是从卫矛科植物雷公藤中提取的环氧二萜内酯化合物，具有抗炎、抗癌等多种药理活性[10－11]，临床用于治疗炎性疾病、自身免疫疾病和肿瘤，高浓度TW可调节细胞周期，通过线粒体凋亡途径诱导心肌细胞发生凋亡[12－13]；此外，高浓度TW可呈剂量依赖性地抑制人类 ether－a－go－go相关基因（hERG）编码的钾通道，抑制心肌细胞复极化时钾离子外向电流，导致动作电位时程延长，明显抑制心肌细胞活性[14]。本研究结果发现，30.0 ng／mL 以上质量浓度的TW才会抑制心肌细胞生长和诱导其凋亡，并对产生损伤作用；较低质量浓度的TW对心肌细胞生长无明显生长抑制作用，与TNF－α联用时，可降低TNF－α对人心肌细胞的生长抑制作用和凋亡诱导作用，可在一定程度上降低TNF－α对人心肌细胞的损伤作用。

综上所述，安全浓度的TW降低TNF－α对人心肌细胞HCM细胞的生长抑制作用和凋亡诱导作用，心肌细胞损伤标志物CK和LDH也会有所降低，说明TW对TNF－α介导的HCM心肌细胞的生长损伤有保护作用，而具体的分子机制和参与信号途径尚未阐明，需要进一步深入研究。