Hippo-YAP通路与肿瘤相关性研究进展

刘思伽 全紫瑶 胡必成 谢圣高

Hippo-YAP通路首次发现于果蝇中，是一个细胞信号转导通路，具有高度保守性，能调节器官大小发育、维持细胞增殖和凋亡的动态平衡。Yes相关蛋白(yes-associated protein, YAP)是Hippo-YAP通路的转录共激活因子，在正常机体内以磷酸化的形式参与信号转导、调节基因转录。YAP是一个癌基因，当YAP过表达或者Hippo-YAP通路异常时，会破坏细胞增凋平衡，造成细胞增殖过度、细胞调亡不足，导致癌症的产生。现综述下Hippo-YAP通路及与肿瘤相关性研究进展。

一、Hippo-YAP通路

在生物学上，Hippo-YAP通路的发现具有里程碑意义。它最先于果蝇体内被发现，后来陆续在哺乳动物中发现其同源蛋白[1]。在进化上，Hippo-YAP通路高度保守。果蝇与哺乳动物同源蛋白对应如下：Hpo与Mst1/2、Sav与WW45、Wts与Lats1/2、Mats与Mob1及 Yki与YAP。Hippo-YAP通路是由一系列蛋白激酶及转录因子组成的激酶链，由上游调节因子、核心组件、下游效应因子及转录共激活因子4部分构成。

1.上游调节因子：Hippo-YAP通路中，目前发现的的上游调节因子有Mer(NF2)、Ex、Fat、GPCR等。Mer 和 Ex的结构中含FERM结构域，可与膜蛋白结合并反应，能进行跨膜信号转导。在果蝇中，Mer与Ex功能部分相同，协同阻碍细胞生长发育，两者失活时会引起细胞增殖过度。Mer 和Ex通过负反馈调节机制来调控Hippo-YAP通路：Mer和Ex能磷酸化Wts，反过来Hippo-YAP通路也能抑制 Mer 和Ex。在哺乳动物中，NF2编码的酶是Mer的同源蛋白。肝脏条件性敲除NF2，将大大提高小鼠发生肝癌的发生率[2]。Fat属前钙黏蛋白家族成员，作为一种感受器来调节Hippo-YAP通路的状态。Fat突变与Ex突变产生的生物学效应类似，通过上调DIAP1的表达，造成细胞过度增殖。近来研究发现， G蛋白偶联受体(G-protein coupled receptor, GPCR)也可调控Hippo-YAP通路，血清中的溶血磷脂酸 (lysophosphatidic acid, LAP)与GPCR相结合后，能抑制Lats1/2，进而活化YAP[3]。对于Hippo-YAP通路的上游调节因子，仍需做更多的进一步研究来发现新成员和阐述其具体机制。

2.核心组件：果蝇Hippo-YAP通路的核心组件是一个串联激酶，由Wts、Hpo、Sav和Mats组成(Sav、Mats分别是Hpo、Wts相对应的调节因子)，通过Sav与Hpo结合使Wts磷酸化，Wts 再与Mat 结合使Yki磷酸化失活，下调DIAP1、bantam及CycE等下游效应因子的表达，从而抑制细胞增殖、促进细胞调亡，维持机体内环境的稳态。哺乳动物Hippo-YAP通路的核心组件则是由Mst1/2、Lats1/2、Sav1及Mob1组成的一条核心激酶链。上游信号分子作用下，Mst1/2发生磷酸化后与Sav1结合，激活Lats1/2和Mob1，活化的Lats1/2磷酸化YAP，使之与14-3-3结合滞于胞质中，抑制下游基因的表达。在这条核心激酶链中，Mst1/2有多种机制使Lats1/2活化[4]。近期研究发现，丝裂原活化蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinase kinase kinase kinase, MAP4Ks)也可发生磷酸化后活化Lats1/2[5～7]。在对Lats1/2的调控上，Mst1/2和MAP4Ks功能上互补。

3.下游效应因子：随着Hippo-YAP通路研究的深入，越来越多的下游效应因子被发现,目前已有DIAP1 、CycE、bantam及CTGF等。研究表明，果蝇调亡抑制蛋白 1 (drosophila inhibitor of apoptosis protein 1, DIAP1) 通过caspase的失活抑制细胞凋亡，CycE表达增加也会阻碍细胞凋亡[8]。在上皮细胞中, CycE可调节细胞周期，使细胞从G1期到S期受阻。Bantam的生物学效应与DIAP1、CycE相似，能双重调节细胞增殖与细胞凋亡。在Hippo-YAP通路中，bantam是独立靶点，它表达异常对DIAP1、CycE的水平不会有影响。在果蝇中，Yki过表达时会增加DIAP1、CycE和bantam的表达，促进细胞过度增殖和抑制细胞调亡。但在哺乳动物中，结缔组织生长因子 (connective tissue growth factor, CTGF)是YAP的直接靶基因，YAP诱导CTGF促进细胞过度生长[9]。

4.转录共激活因子：YAP是Hippo-YAP通路的转录共激活因子。人类YAP定位于染色体 11q13，在各组织中广泛表达[10]。1994年，Sudol最早发现并命名了YAP。YAP有两种亚型：YAP1和 YAP2，二者含 WW 结构域的数目分别为一个和两个，YAP2活性更强。另外, TAZ(YAP的同源蛋白) 与YAP的功能相似。YAP能结合含PPXY的配体并与之相互作用。YAP 本身不能直接与DNA结合，需要结合转录因子(如TEAD)后才能促进下游基因的表达，进而调节细胞生长发育。YAP-TEAD是由YAP的N末端和TEAD的C末端的结构域调节结合而成。一般YAP存在于胞质或胞核,依据它所存在的位置可判断其是否具有活性。在Hippo-YAP通路中，YAP的失活往往通过磷酸化来实现。胞质中的YAP未被磷酸化时，它将进入细胞核结合TEAD，然后一起促进基因转录发挥其生物活性；胞质中的YAP被磷酸化后，将结合14-3-3蛋白滞于胞质中，抑制下游基因转录。YAP是一个癌基因，YAP过表达时，会引起组织器官过度增长；YAP失活时，会引起组织器官发育不良。

二、Hippo-YAP通路的调控作用

1.调节细胞增殖和凋亡：维持细胞增殖和凋亡的动态平衡能保证机体内环境的稳态。Hippo-YAP通路中的YAP被磷酸化而失活，通路中的调节因子通过磷酸化负性调控 YAP水平，激活YAP会造成细胞增殖过度与调亡不足、细胞间接触抑制丧失乃至肿瘤的发生。当某些调节因子突变时，能增强 YAP 的活性，进而增加下游效应因子DIAP1和CycE等的表达，导致细胞增殖过度、细胞调亡不足。

2.调控器官大小：正常组织中，YAP有一定量的表达。YAP过表达会导致组织器官增生，YAP失活会导致组织器官萎缩。Hippo-YAP通路中的上游调节基因通过级联反应使YAP磷酸化失活，滞留于胞质内，进而调控器官大小、控制细胞数量。当这些基因突变或缺失时，会使YAP的活性大大增加，引起细胞过度生长发育乃至癌症的发生。例如敲除小鼠的Mst1/2基因(Mst1/2为上游调节因子，可调控器官大小)，会激活YAP导致肝癌的发生。

3.调节细胞接触性抑制：细胞接触性抑制是一种保持细胞正常形态的调节机制。当细胞接触性抑制丧失时，癌细胞呈锚定非依赖性生长。经研究表明，YAP过表达会导致细胞接触性抑制丧失，产生某些致癌特性如锚定非依赖性生长、上皮细胞-间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)。TAZ也可促进EMT发生, Lats能使TAZ磷酸化失活后抑制EMT的发生。可见，Hippo-YAP通路能增强细胞接触性抑制。

三、Hippo-YAP通路与肿瘤

Hippo-YAP通路由一种癌基因和多种抑癌基因组成，是一条肿瘤抑制通路，当激活癌基因或抑癌基因失活时通路异常，会导致肿瘤的发生。YAP是一个癌基因，增加YAP的表达和活性会促进细胞恶化，YAP过表达会导致肿瘤的产生。下面将讨论YAP在不同肿瘤中的表达情况及作用。

1.卵巢癌：卵巢癌是一种病死率最高的女性恶性肿瘤，晚期易复发。对于复发性卵巢癌，多采取姑息疗法。在卵巢癌细胞系中，YAP过表达会促进细胞增殖，诱导EMT并赋予化疗特性。升高核YAP表达，反映YAP活化的基因表达特征与卵巢癌患者预后不良密切相关。Steinhardt等[11]通过比较卵巢癌组织和正常卵巢组织中YAP核染色阳性率，发现二者差异有统计学意义，胞质中差异同样显著，同时表明YAP过度表达的卵巢癌患者预后性较差。Zhang等[12]运用免疫组织化学技术检测了284 例人卵巢癌组织，40例组织在细胞核中YAP高表达，表明卵巢癌预后性较差。Hall等[13]收集卵巢癌患者的临床数据后进行了分析研究，发现YAP的表达水平与患者5年生存率有关。胞质中YAP 低表达者与胞核中YAP高表达者比较，5年生存率能提高一半。对于顺铂所介导的细胞凋亡，灭活YAP能增强癌细胞的敏感度，表明在卵巢癌的发生、发展中，YAP作为癌基因有着十分重要的作用。最近研究发现，有两种miR(miR-129-5p、miR-509-3p)可抑制YAP的活性和减弱肿瘤恶性特征。值得注意的是，YAP似乎与颗粒细胞瘤(占恶性性索间质瘤的70%)生物学有关。YAP过表达会促进颗粒细胞瘤细胞增殖、迁移和类固醇生成，与正常组织比较，核YAP表达在肿瘤组织中更为常见。

2.乳腺癌：乳腺癌是一种发生率最高的女性恶性肿瘤，三阴性乳腺癌是目前国内外研究热点。在未转化的乳腺癌细胞系或乳腺上皮细胞中，YAP过表达会诱导细胞增殖、EMT、锚定非依赖性生长。在乳腺癌小鼠模型中，敲除YAP能延缓乳腺癌的发生，抑制乳腺癌转移。Wang等[14]检测了69例人乳腺癌组织，发现52例有YAP表达，表明YAP是癌基因，能够显著增强细胞增长。Overholtzer等[15]研究也认为YAP可能是致癌因子。通过小鼠乳腺癌模型实验，分析染色体扩增，发现其YAP过表达，造成了一些表型改变，如促进细胞增殖、阻碍细胞凋亡、生长因子非依赖性增生及细胞上皮间质转化等，这些都标志着细胞恶化。近期研究发现， YAP可能与乳腺癌的潜在遗传背景有关，从而在不同的内在亚型中产生不同的功能。例如，YAP与突变p53相互作用，可促进细胞周期进程的转录程序。此外，YAP参与肿瘤-基质串扰，故应在不同的细胞区室(例如肿瘤和基质细胞)中分析YAP的表达。

3.肝癌：肝癌是一种病死率较高的恶性肿瘤，且术后易复发。Zhao等[16]检测了115 例肝癌组织样本，发现半数的肝癌组织YAP 表达呈强阳性(胞核中表达阳性率极其高)，95%的正常肝细胞的YAP不或弱表达，表明YAP 很有可能参与肝癌细胞的发生、发展。Hayashi等[17]通过实验表明敲除TAZ，YAP会补偿性增加。在肝癌中YAP和 TAZ都是高表达，但TAZ的表达更高。Wu等[18]对肝癌患者的YAP进行了研究，发现YAP高表达者肿瘤更大，更易发生肝硬化、肝转移和肿瘤多发灶等病症。在肝癌中，YAP的致瘤性与增加氨基酸摄取、激活Notch信号转导、激活mTORC1及上调氨基酸转运蛋白有关。YAP的表达水平与肝细胞癌患者预后不良有关，Hippo-YAP通路异常会导致低生存率。最近研究发现，激活YAP与基因组不稳定性和多倍体细胞分裂有关。此外，YAP-TEAD复合物通过诱导miR-130a(YAP的直接靶基因)的表达形成一个正反馈回路，而miR-130a可抑制YAP的天然抑制剂退变样蛋白4(vestigial like protein 4, VGLL4)。阻断YAP-TEAD相互作用可阻碍YAP介导的肝细胞癌的发生、发展，并且在治疗上有学者提出了分化诱导疗法，即用miRNA-脂质纳米粒来抑制YAP活性。

4.胃癌：胃癌是一种病死率高居第2位的恶性肿瘤，且治疗预后较差。Lam-Himlin等[19]对169 例胃癌组织进行了分析，研究表明相较于正常上皮黏膜细胞，胃癌细胞的YAP表达明显更高，YAP应该参与了肿瘤的发生。Da等[20]运用生物技术检测了98 例胃癌组织，发现YAP能促进Survivin 的表达，通过抑制细胞凋亡导致胃癌的发生。Sun等[21]研究表明Hippo-YAP通路能抑制细胞增殖，YAP是致癌因子，过表达会造成小鼠肝脏变大和恶性转化。敲除YAP会阻碍胃癌细胞增殖、运动和侵袭，且核YAP表达赋予了低疾病特异性生存率。破坏YAP-TEAD与VGLL4模拟肽的相互作用可抑制体内外肿瘤生长。另外，Hippo-YAP通路异常也参与食管和胃上皮癌的发生。在食管腺癌、转移性胃癌及胃腺癌中，YAP也是高表达。

5.肺癌：肺癌是一种发生率、病死率极高的恶性肿瘤，其中非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)占肺癌的85%。在NSCLC中，YAP呈过表达。沉默YAP会抑制细胞增殖、促进细胞凋亡、诱导细胞周期停滞、阻碍肺癌的发生、发展进程。Wang等[22]对92例NSCLC组织进行了分析，发现YAP 的表达率为66.3%，YAP表达阳性率较正常肺组织明显要高，均聚在核内，癌组织的TMN 分期与YAP 的表达呈正相关。在肺癌小鼠模型中，YAP可抑制肺腺癌向肺鳞状细胞癌转分化过程，其过表达可促进肺腺癌的发展。Kim等[23]分别对肺腺癌及肺鳞状细胞癌中YAP的表达做了研究。单因素分析表明，在肺腺癌核内YAP的高表达与MAPKs和CycA 的表达相关，且在肺鳞状细胞癌胞质中YAP高表达与组织学分级和TMN 分期有关；多因素分析阐明，在肺腺癌核内YAP的表达与CycA的表达独立相关，胞质中YAP的表达是TMN低分期肺鳞状细胞癌的独立指示物。研究表明对于肿瘤亚型的鉴别，YAP有着重要的作用。虽然Hippo通路异常会导致恶性胸膜间皮瘤，但活化YAP却可抑制具有非典型特征(如神经内分泌标志物低表达、预后良好、化疗敏感度增加)的小细胞肺癌(small cell lung cancer, SCLC)。可见，在NSCLC和SCLC中，YAP的作用相反。

四、针对Hippo-YAP通路的靶向治疗

研究表明，阻断YAP介导的转录可有效治疗各种肿瘤。目前没有直接抑制剂，用于临床治疗的大多是能抑制YAP活性的药物。在哺乳动物中，TEAD是与YAP结合的主要转录因子。阻断YAP -TEAD复合物的形成是最直接有效的抑制YAP致瘤效应的方法。维替泊芬 (verteporfin, VP) 是一种卟啉化合物，临床上用于治疗黄斑变性的光敏剂，毒性不良反应小。研究表明，VP不仅可抵消敲除NF2或YAP过表达诱发的肝脏过度生长，也可有效地杀死携带Gq/11突变的葡萄膜黑素瘤细胞，且反复给予VP可有效延缓肿瘤进展。有研究发现GPCR信号可调控Hippo-YAP通路，多巴酚丁胺(G蛋白偶联β受体激动剂)可促进YAP的胞质聚集，从而阻碍YAP介导的转录。最近有研究报道甲羟戊酸途径也可调控YAP活性。该途径的产物异戊二烯焦磷酸可促进Rho GTP酶活性，从而导致YAP的核定位和活化。他汀类药物是一类降胆固醇药物，是该途径关键酶HMG-CoA还原酶的抑制剂(HMG-CoA还原酶可活化Rho GTP酶)。他汀类药物以不依赖Lats1/2的方式，通过降低RhoGTP酶活化来抑制YAP活性。除他汀外，双膦酸盐也可抑制甲羟戊酸途径，产生这种生物学效应。Oku等[24]研究发现在乳腺癌细胞中，氟伐他汀能抑制甲羟戊酸途径，阻止YAP的核内转运和去磷酸化，具有抗癌细胞增殖和促癌细胞凋亡作用。同时还发现帕唑帕尼和达沙替尼也促进YAP的核累积，当氟伐他汀、帕唑帕尼和达沙替尼三药联用时，抗癌效应显著增强。进一步研究发现，三药联用可增加YAP介导型乳腺癌对化疗药物(阿霉素、紫杉醇等)的敏感度。另外，发现降糖药二甲双胍也能抑制YAP活性。二甲双胍可激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)，继而通过活化Lats和直接YAP磷酸化来抑制YAP活性。

综上所述，Hippo-YAP通路是一个调节细胞增殖与调亡的信号转导通路，YAP 是此通路的靶因子。Hippo-YAP通路异常或YAP过表达时会导致肿瘤的产生，YAP是肿瘤靶向治疗的有效靶点。通过探讨Hippo-YAP通路调控机制及其与卵巢癌、乳腺癌等肿瘤的关系，为研究其他肿瘤的诊断、治疗和预后提供了参考。过去几年，Hippo-YAP通路已经在机制研究方面取得了很大的进步，而进一步的肿瘤靶向治疗研究将会是未来所面临的重大课题。