脓毒症患者外周血HMGB1、TLRs水平与应激性溃疡的相关性

陆 刚 张 羽 张学敏

脓毒症(sepsis)是指由细菌或真菌等病原体毒素释放并引发全身炎症综合反应的病症，并以机体免疫系统激活并活化多种炎性因子进而导致组织器官、免疫系统等发生损害为主要病理特征[1]。其发病机制尚未完全阐明。研究显示脓毒症可进一步发展为重症脓毒症或多器官功能障碍综合征(MODS)，甚至脓毒症休克，而MODS等引发机体处于应激状态导致应激性溃疡的发生[2]。因而探寻预测脓毒症发展为应激性溃疡的相关生物学指标对延缓或控制病情发展具有重要意义。高迁移率族蛋白B1(HMGB1)可调节多种生物病理生理过程并参与机体炎性反应或肿瘤形成过程[3]。机体特异性/非特异性免疫过程中Toll样受体(Toll-like receptors，TLRs)充当重要蛋白分子，可识别病原相关分子模式的受体，同时TLRs介导的信号转导通路对机体调节炎症免疫反应发挥重要作用[4]。关于HMGB1、TLRs在脓毒症发生应激性溃疡过程中的作用研究尚未见报道，因此本研究主要探讨脓毒症患者外周血HMGB1、Toll样受体2(TLR2)、Toll样受体4(TLR4)水平与应激性溃疡的相关性，为临床早期预测应激性溃疡提供参考依据。

资料与方法

1.一般资料:选取2016年8月～2017年4月笔者医院收治的62例脓毒症患者与71例严重脓毒症患者作为研究对象并分别设为脓毒症组与严重脓毒症组，且均分别符合相关诊断标准[5,6]。脓毒症组中男性34例，女性28例，患者年龄为42～72岁，平均年龄63.25±10.54岁，严重脓毒症组中男性32例，女性39例，患者年龄为42～73岁，平均年龄64.13±10.69岁。入院后根据所有患者临床资料与多器官功能障碍综合征(MODS)评分，将患者发生应激性溃疡作为阳性组(76例)，未发生应激性溃疡作为阴性组(57例)[7]。另选取同期健康体检志愿者58例为对照组，其中，男性30例，女性28例，年龄为40～71岁，平均年龄62.34±10.39岁。各组年龄、性别比较，差异无统计学意义(P>0.05)。纳入标准：近期未服用影响免疫功能药物者；未患有血液疾病者；受试者知情且签署同意书。排除标准：自身免疫异常性疾病者；合并冠心病等严重疾病患者；合并其他恶性肿瘤患者；慢性肝脏、肾脏疾病终末期患者；临床资料不全者。

2.方法：(1)制备外周血单个核细胞：无菌条件下采集受试者清晨空腹外周静脉血3ml，并置于EDTA抗凝管中，采用Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC)，并以3000r/min转速离心20min，将分离得到的PBMC置于-20℃冰箱中保存待用。(2)实时荧光定量PCR法检测外周血HMGB1、TLR2与TLR4表达量：采用Trizol试剂盒(北京百泰克公司)提取PBMC总RNA，并将RNA反转录为cDNA。运用Primer 4.1引物设计软件HMGB1引物序列，TLR2与TLR4引物详见表1。实时荧光定量PCR按照SYBR Green Master(德国Qiagen公司)说明书操作，每组样品设3个复孔并置于实时荧光定量PCR仪上进行反应，程序为95℃预变性1min，95℃ 15s，60℃ 60s，共40个循环，HMGB1、TLR2、TLR4均以GADPH为内参基因，并采用2-ΔΔCt算法计算HMGB1、TLR2、TLR4相对表达量。(3)检测病情相关指标:抽取所有脓毒症患者空腹静脉血3ml，离心后吸取血清并采用酶联免疫吸附法(ELSA)试剂盒检测白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素8(IL-8)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、一氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、超敏C反应蛋白(hs-CRP)、炎性介质降钙素原(PCT)，所用仪器为美国Bio Tek全自动荧光酶标免疫测定仪。采用放射免疫法检测患者血清胃泌素(GAS)，并按照试剂盒(上海酶联生物科技有限公司)操作，对所有患者均进行急性生理学及慢性健康状况评分(APACHEⅡ)。

表1 实时荧光定量PCR引物序列

结 果

1.3组受试者外周血HMGB1、TLRs表达量比较:脓毒症组患者外周血HMGB1、TLR2、TLR4水平均显著高于对照组(P<0.05)，严重脓毒症组患者外周血HMGB1、TLR2、TLR4水平均显著高于脓毒症组(P<0.05)，详见表2。

表2 3组受试者外周血HMGB1、TLRs表达量比较

与对照组比较，*P<0.05；与脓毒症组比较，#P<0.05

2.阳性组与阴性组患者外周血HMGB1、TLRs表达量比较:阳性组患者外周血HMGB1、TLR2、TLR4水平显著高于阴性组(P<0.05)，详见表3。

表3 阳性组与阴性组患者外周血HMGB1、TLRs表达量比较

3.阳性组、阴性组患者临床指标的比较:观察并比较阳性与阴性组患者临床指标，阳性组前炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-8与氧化应激指标NO、MDA及PCT、hs-CRP、GAS水平及APACHEⅡ评分均显著高于阴性组(P<0.05)，而SOD水平显著低于阴性组(P<0.05)，详见表4。

4.Logistic分析脓毒症患者发生应激性溃疡的相关因素:将影响脓毒症患者发生应激性溃疡的因素进行Logistic分析，脓毒症患者外周血HMGB1、TLR2与TLR4水平是脓毒症患者发生应激性溃疡的独立影响因素，详见表5。

5.ROC分析HMGB1、TLRs对应激性溃疡的诊断价值:ROC分析检测HMGB1、TLRs水平对应激性溃疡的诊断价值，HMGB1的敏感度为71.05%、 特异性为91.23%、截断值为3.86；TLR2的敏感度为73.68%、特异性为73.68%、截断值为3.87；TLR4的敏感度为65.79%、特异性87.72%、截断值为4.63，详见图1、表6。

表4 阳性组、阴性组患者临床指标的比较

表5 脓毒症患者发生应激性溃疡的相关因素的Logistic分析

图1 脓毒症患者外周血HMGB1、TLRs对应激性溃疡的ROC分析

表6 脓毒症患者外周血HMGB1、TLRs对应激性溃疡的ROC分析

检测指标AUC标准误Z95% CIPHMGB10.8660.03111.872 0.796～0.9190.000TLR20.7650.0416.505 0.684～0.8340.000TLR40.8110.037 8.3010.734～0.8730.000

讨 论

脓毒症主要是指损伤或感染引起宿主发生免疫及炎性反应，严重时可引发多器官功能障碍甚至应激性溃疡[8]。机体内炎症或氧化应激反应可损害细胞对氧的利用效率并对组织器官造成损伤[9]。目前关于脓毒症发生机制尚未完全阐明，以往研究报道指出HMGB1与晚期糖基化终产物受体(RAGE)及TLRs可参与炎性疾病发生过程并发挥致炎作用[10～12]。本研究将通过检测脓毒症患者外周血HMGB1与TLRs水平并探究其与应激性溃疡发生的关系，为进一步明确脓毒症发病机制提供参考依据。

HMGB1作为炎性因子可参与体内炎性反应，HMGB1与受体RAGE/TLRs结合是引发炎症疾病的重要通路[13]。核转录因子κB(NF-κB)可在应激性与炎性反应等过程中发挥重要功能，研究表明HMGB1与受体结合可活化NF-κB信号通路并促进炎性因子合成及释放进而参与多种组织器官病理及生理过程[14]。本研究结果显示脓毒症组患者外周血HMGB1水平明显升高，且严重脓毒症组显著高于脓毒症组，阳性组显著高于阴性组，说明脓毒症患者HMGB1水平显著升高且随病情加重其表达水平升高更显著。NF-κB信号转导途径活化后可促进炎性因子表达导致氧化应激反应的发生进而促进疾病发展，而GAS水平可反映机体应激状态并可作为应激性溃疡发生的重要指标[15～17]。本研究结果显示阳性组IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-8与NO、MDA、PCT、hs-CRP、GAS水平均显著高于阴性组，而SOD水平显著降低，提示脓毒症患者外周血HMGB1水平升高可影响前炎因子与氧化应激指标等表达水平进而参与脓毒症进展为应激性溃疡的过程。

TLRs家族中TLR2、TLR4位于细胞表面并可引发机体免疫过度反应进而导致感染性与慢性炎性疾病的发生，现多以TLR2、TLR4作为防治疾病的重要靶点。TLR2、TLR4可加快心肌收缩性有关炎性蛋白分泌并引发充血性心力衰竭等疾病。研究表明TLR2、TLR4均可识别脂多糖并引发机体炎性反应并促进疾病发展进程[18]。本研究结果显示脓毒症组患者外周血TLR2、TLR4水平均显著高于对照组，严重脓毒症组显著高于脓毒症组，进一步分析显示阳性组显著高于阴性组，说明脓毒症与应激性溃疡患者外周血TLR2、TLR4水平均显著升高且随着疾病严重程度的增加而显著升高。

本研究分析应激性溃疡患者临床指标的变化，结果显示阳性组IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-8、NO、MDA、PCT、hs-CRP、GAS水平及APACHEⅡ评分均显著高于阴性组，而SOD水平显著低于阴性组，提示HMGB1与受体TLR2、TLR4结合并激活NF-κB信号通路而促使炎性因子等分泌增加进而在脓毒症发生及应激性溃疡发生过程中发挥重要作用。同时Logistic分析显示脓毒症患者外周血HMGB1、TLR2与TLR4水平是发生应激性溃疡的独立影响因素，并将影响脓毒症发展为应激性溃疡的独立影响因素进行ROC分析，结果显示HMGB1、TLR2、TLR4均具有较高的敏感度与特异性，提示HMGB1、TLR2与TLR4均可作为应激性溃疡的预测因子。本研究结果揭示外周血HMGB1、TLR2与TLR4水平升高与脓毒症患者应激性溃疡的发生密切相关，且均可参与疾病发生、发展并可作为预测脓毒症患者病情的重要指标。

综上所述，外周血HMGB1、TLR2与TLR4水平高低可能成为脓毒症疾病严重程度及应激性溃疡发生的重要指标，为临床对应激性溃疡的预测提供依据。