补肾止颤方联合埋针对帕金森病大鼠行为学>及黑质区自由基清除的影响

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帕金森病(Parkinson′s disease，PD)的主要病变在纹状体及黑质的多巴胺通路上，以中脑选择性黑质多巴胺能神经元进行性丢失为其主要病理改变[1]。PD确切的发病机制迄今尚未完全清楚，目前以自由基清除系统功能降低或失活为主要原因的相关学说占主导地位[2]。临床运用补肾止颤方联合埋针治疗PD病人，病人情绪、运动功能和生活质量明显改善，临床效果较好[3-4]，但其确切的作用机制尚未十分清楚。本研究参照刘雨清等[5]的蛋白酶抑制因子(proteasome inhibitors I，PSI)皮下注射法制作慢性PD大鼠模型，通过观察各组大鼠行为学改变并测定其中脑黑质区脂质过氧化物(LPO)和谷胱甘肽(GSH)含量及超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性变化，探讨补肾止颤方联合埋针保护PD大鼠中脑黑质区神经元细胞的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 SPF级成年雄性SD大鼠50只(所需样本40只，10只大鼠以备实验过程中大鼠死亡时及时补充)，体重(250±20) g，均购自广西医科大学实验中心(scxk桂2009-0002)。实验前所有大鼠均在通风、温度、湿度适宜的专用饲养室内适应性饲养1周。实验过程中死亡大鼠及时以同批次大鼠补充。

1.1.2 主要药品 补肾止颤方：鹿角胶10 g，生龟板20 g，党参15 g，阿胶10 g，白芍30 g，枸杞子30 g，火麻仁15 g，生地25 g，麦冬15 g，肉苁蓉30 g，生鳖甲15 g，黄精10 g，山萸肉10 g，天麻15 g，钩藤30 g，炙甘草6 g，以上16味为单味免煎颗粒，均由江阴天江药业有限公司制备(生产批号：1206003)；参照《现代医学实验动物学》[6]方法计算给药量，把药物配制成含生药2.574 g/mL，大鼠灌胃液体量为每次1 mL/100 g。多巴丝肼片：每片250 mg(上海罗氏制药公司生产，批号：SH1689)。埋针针具：选用图钉型无菌揿针(顺和牌无菌揿针，苏州市华伦医疗用品有限公司，批号：12197)。

1.1.3 主要试剂 LPO试剂盒、GSH试剂盒、GSH-Px测定试剂盒、SOD试剂盒、总蛋白测定试剂盒(南京建成生物工程公司)；PSI(Calbiochem公司)；其他试剂均为市售、分析纯。

1.1.4 主要仪器 自动组织脱水机及组织包埋机(广州市华俊医疗器械有限公司)，DB037-003型大鼠脑切片模具(北京智鼠多宝生物科技有限责任公司)，LEICA RM2235型组织切片机，9602G型国产酶标仪(北京普朗新技术有限公司生产)，BX60型光学显微镜(日本奥林巴斯公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 模型制备 将40只SD雄性大鼠随机分为假手术组(10只)和造模组(30只)，造模组采用蛋白酶抑制因子皮下注射法制作PD模型后，随机分为模型组、多巴丝肼组、针药结合组，各10只。采用胡玉英等[4-5]研究的方法皮下注射蛋白酶抑制因子制作慢性PD大鼠模型。造模期间每日观察并同时记录各组大鼠的一般状况(如精神状态、反捕、饮食、体毛、肢体震颤、肢体活动、僵直等)，造模4周后， 参照 “网格试验”[7]及平衡杆试验方法[8]检测大鼠的行为学变化，对各组大鼠进行行为学检测，以判断造模成功与否，其间死亡大鼠及时补充同一批次的大鼠；直至4周造模时间结束未出现行为学改变者为失败模型，不纳入本实验，再随机补充同一批次的大鼠，将其造模成功后纳入，以保证每组实验动物的数量不变。

1.2.2 给药方法 造模成功后第2天开始，模型组、假手术组均予生理盐水1 mL/(100 g·d)灌胃；多巴丝肼组予多巴丝肼200 mg/(kg·d)灌胃；针药结合组予补肾止颤方1 mL/(100 g·d)灌胃，并结合埋针疗法。各组大鼠均予隔天治疗(每周一、周三、周五)，连续治疗3周。每组最后均为10只大鼠。

1.2.3 埋针治疗处方 肝俞、肾俞、百会、舞蹈震颤区，取穴参照华兴邦的《大鼠穴位图谱的研制》[9]。

1.2.4 标本采集与制备 各组大鼠治疗3周后，采集大鼠脑组织标本，参照文献[4]对大鼠脑组织进行包埋、切割。接着分离黑质所在的部位(在出现海马连接处切面的腹侧面即开始出现黑质，至桥横纤维出现处黑质基本消失)。将前囟后4～7 mm的中脑黑质所在的脑部冠状切片组织提取出来，在光学显微镜下把黑质组织分离出来，并提取4个部分的黑质组织，制备成匀浆，检测实验指标。

1.3 观察指标

1.3.1 一般状况与行为学的检测 用药期间每日观察并记录各组大鼠的一般状况，治疗3周后，进行行为学检测。

1.3.2 中脑黑质区GSH、LPO含量及GSH-Px、SOD活性检测 依据南京建成生物工程研究所提供的GSH、LPO、GSH-Px、SOD测试盒操作说明使用分光光度法测定中脑黑质区中GSH、LPO的含量及GSH-Px、SOD活性。

2 结 果

2.1 一般情况 注射蛋白酶抑制因子第2周，造模组大鼠表现为活动减少，毛色逐渐发黄，精神萎靡，自主活动及进食情况明显减少，动作迟缓，被抓时反抗动作减少。在第2周的注射结束后，造模组大鼠活动较前更少，仅见其偶尔拖着脚转动几下，且其尾巴和四肢明显僵硬，躯体和四肢呈现卷曲姿态，行走时重心明显降低，在伸展姿态时腹部接触地面，拖步行走，起身觅食的时候，前爪出现震颤。直至4周造模时间结束，造模组大鼠均出现持续运动迟缓，行走时四肢和躯体的伸展缓慢，个别大鼠出现惊厥甚至死亡现象(死亡大鼠2只)。而假手术组大鼠皮毛光滑，活泼好动，饮食如常，体重增长。为保证实验动物每组数量不变，死亡的2只大鼠以同批次实验大鼠予补充入组，补充的大鼠均造模成功。

治疗后，假手术组大鼠皮毛光滑，活泼好动，饮食如常。模型组大鼠的一般状况与造模成功时的表现大致相同。多巴丝肼组大鼠毛色、饮食均逐渐有所恢复，活动有所增多，但较假手术组仍差，前爪震颤、尾巴四肢僵硬等症状较模型组均明显减轻。针药结合组大鼠皮毛、活动、饮食等方面逐渐恢复，但较假手术组大鼠相比略差。

2.2 行为学检测结果 与假手术组比较，模型组大鼠的网格试验和平衡杆试验移动潜伏期及过杆时间均显著延长(P<0.01)；与模型组比较，多巴丝肼组和针药结合组网格试验及平衡杆试验移动潜伏期和过杆时间均明显缩短(P<0.01)；而针药结合组与多巴丝肼组比较，各移动潜伏期及过杆时间均显著缩短(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠行为学检测结果(±s) s

模型组与假手术组比较，1)P<0.01；多巴丝肼组、针药结合组与模型组比较，2)P<0.01；针药结合组与多巴丝肼组比较，3)P<0.05

2.3 GSH、LPO含量及GSH-Px、SOD活性 与假手术组相比较，模型组GSH含量和GSH-Px、SOD活性均明显降低(P<0.01)；与模型组相比较，多巴丝肼组和针药结合组GSH含量和GSH-Px、SOD活性均明显升高(P<0.01)，且针药结合组较多巴丝肼组升高明显(P<0.05)。与假手术组相比较，模型组LPO含量显著升高(P<0.01)；与模型组相比较，多巴丝肼组和针药结合组LPO含量均明显降低(P<0.01)，且针药结合组较多巴丝肼组降低明显(P<0.05)。见表2。

表2 各组GSH、LPO含量及GSH-Px、SOD活性比较(±s)

模型组与假手术组比较，1)P<0.01；多巴丝肼组、针药结合组与模型组比较，2)P<0.01；针药结合组与多巴丝肼组比较，3)P<0.05

3 讨 论

PD当归属于中医学“颤震”范畴。研究发现肝肾俱亏是PD的病机关键，据此本研究提出从肝肾论治PD，补阴以制阳，创制了补肾止颤方[3-4，10]。补肾止颤方由龟鹿二仙膏合大定风珠化裁而来。龟鹿二仙膏有生精、益气、养血、阴阳并补的特点，大定风珠具育阴潜阳、柔肝熄风功效，配伍山萸肉、黄精、肉苁蓉滋肾益肝；天麻、钩藤镇痉熄风止颤，诸药合用，共奏滋养肝肾、益精填髓、补气养血、舒筋通络、熄风止颤之功。现代药理研究显示：龟鹿二仙颗粒可显著升高衰老模型大鼠血清和组织匀浆中的SOD、GSH-Px活性及显著降低丙二醛(MDA)含量[11]；大定风珠能抗氧自由基，保护神经元[12]。相关临床观察显示，滋补肝肾的中药可减少左旋多巴药物的用量，减轻其副作用，改善PD病人帕金森氏病综合评分量表(UPDRS)评分[13-14]。现代药理学研究也提示补肾中药能改善PD临床症状、延缓PD进展[15-16]。埋针疗法的优势在于其对针刺区的机械性刺激持续存在并序贯而发，可产生“经络后发感传效应”。埋针疗法处方所选取的舞蹈震颤区是头针治疗PD的特效区域[17]。

PD黑质多巴胺能神经元进行性丢失与自由基清除系统功能降低或失活有关[18]。研究显示，在多巴胺能神经元变性的过程中氧化应激起着重要作用，而PD病人体内氧化应激反应加强，使机体氧自由基产生过多，这是导致多巴胺能神经元凋亡的主要原因[19-21]。脑组织内的SOD、GSH-Px、GSH等物质均能够清除自由基[22]。PD大鼠脑组织中GSH含量明显减少时，机体清除自由基的能力下降，从而引起LPO及其代谢产物MDA生成明显增多，导致PD大鼠脑组织神经元变性死亡[23]。机体清除氧自由基能力的高低间接取决于SOD的活力，GSH-Px可以特异性催化GSH对于H2O2的还原反应，故机体清除自由基能力的高低直接取决于GSH-Px的活力[24]。

补肾止颤方联合埋针疗法能明显改善PD模型大鼠的行为学变化，其机制可能是通过提高中脑黑质区内GSH含量及GSH-Px、SOD活性，降低LPO的含量，增强中脑黑质区自由基清除能力。