苦瓜总皂苷对心力衰竭大鼠心肌凋亡的影响

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心力衰竭(heart failure，HF)是临床常见的一种心血管疾病，是各种心脏相关疾病的终末期结果，主要特点为心室功能下降以至于心脏排血功能不能满足身体代谢所需要的一种病症，在临床中主要表现有呼吸困难、体力受限以及水肿等[1-2]。近年来心力衰竭呈相对高发的态势，最新的研究显示，目前我国成人心力衰竭患病率约为1.2%[3]。对于心力衰竭，中医没有明确的论述，也找不到等同于心力衰竭的较为确切的病名，在诊断时根据病人临床表现，将其归属于“心悸”“心痹”“怔忡”“咳嗽”“喘证”“积聚”“痰饮”“水肿”及“虚劳”等范畴[4]。苦瓜是人们喜欢的一种蔬菜，有研究显示苦瓜对“喘证”“水肿”及“虚劳”等症状有很好的调节作用[5]，苦瓜总皂苷是从苦瓜中提取的一种皂苷类混合物，有文献报道苦瓜总皂苷对心肌损伤的作用[6]，但将其用于慢性心力衰竭的研究较少，本研究采用苦瓜总皂苷治疗盐酸异丙肾上腺素(ISO)引起的慢性心力衰竭大鼠，观察其对心肌组织凋亡因子Caspase-8、Bcl-2表达的影响，以探讨苦瓜总皂苷治疗慢性心力衰竭的部分作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂和仪器

1.1.1 实验动物 雄性清洁级SD大鼠60只，大鼠体重200 g左右，购于华中科技大学同济医学院动物实验中心，大鼠在购买后饲养于江汉大学动物实验房，按照标准条件饲养。

1.1.2 实验试剂 盐酸异丙肾上腺素注射液购于上海禾丰制药有限公司；苦瓜总皂苷购于湖北天合化工有限公司；大鼠肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-6(IL-6)酶联免疫(ELISA)检测试剂盒购于武汉博士德生物有限公司；兔抗大鼠Caspase-8抗体、兔抗大鼠Bcl-2抗体以及兔抗大鼠β-actin抗体购于美国Santa公司；上述抗体对应2抗、兔SP即用型检测试剂盒以及3，3′-二氨基联苯胺(3，3′-diaminobenzidine，DAB)试剂盒购于北京中杉金桥生物技术有限公司；二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量试剂盒和总蛋白提取试剂盒、总RNA提取试剂盒购于北京天根生物公司；引物由上海英俊生物公司设计并生产。

1.1.3 实验仪器 Histostar型全自动包埋机[新发现科技(中国)有限公司]；CUT4062型石蜡切片机(德国SLEE)；CX23型光学显微镜[奥林巴斯(中国)有限公司]；低温高速型离心机(北京时代北利离心机有限公司)；-20 ℃以及-80 ℃冰箱(海尔公司)；AE200S型电子分析天平(美国梅特勒-托利多仪器有限公司)；Benchmark Pl型酶标仪(美国BioTek公司)；Bio-rad蛋白电泳仪(美国伯乐公司)；Applied Biosystems pcr仪(上海赛默飞世尔公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 分组方法 60只大鼠适应性喂养14 d后，按照随机数字表法分为正常组、模型组及苦瓜总皂苷低、中、高剂量治疗组，每组12只。

1.2.2 造模方法 除正常组外，其余4组给予造模；造模前给予大鼠12 h禁食不禁水，根据文献[7]报道的方法构建心力衰竭大鼠模型，具体为给予大鼠皮下多点注射盐酸异丙肾上腺素85 mg/kg，24 h后相同注射部位再注射1次。1 d后检验造模是否成功。造模成功的标准为B超检验结果有明显的心功能异常。

1.2.3 治疗方法 造模成功后给予对应治疗。正常组和模型组给予生理盐水0.5 mL/(kg·d)皮下注射；苦瓜总皂苷低、中和高剂量组分别给予苦瓜总皂苷10 mg/(kg·d)、 20 mg/(kg·d)和40 mg/(kg·d)皮下注射。均治疗8周。

1.2.4 一般情况观察 从造模前到处死大鼠整个过程中，密切监视大鼠的日常情况，主要为精神状态、毛色光泽度、毛发是否粘连、饮水和摄食量等。

1.2.5 心功能测定 治疗结束后，给予大鼠禁食，限制饮水12 h，称重后腹腔注射30 mg/kg的3%戊巴比妥钠麻醉大鼠，大鼠麻醉后固定于解剖板上，切开颈部，将右颈总动脉分离后，内充含有0.1%肝素的生理盐水导管插入左心室，稳定 20 min后，基于RM6240多道生物信号采集系统，记录收集到的压力曲线，同时根据公式计算平均心室舒张压(LVDP)、平均左室峰压(LVSP)、心室内压最大上升速率(+dp/dtmax)及平均等容舒张期室内压最大下降速率(-dp/dtmax)。

1.2.6 ELISA法检测大鼠血清 TNF-α 、IL-6水平 剖开大鼠腹腔，找到腹主动脉，用10 mL注射器小心抽取血液置于1.5 mL的离心管中3 000 r/min离心10 min，离心后保留上清液，按照试剂盒说明书，用ELISA法测定TNF-α 、IL-6。

1.2.7 心肌组织苏木精-伊红染色(HE染色) 将大鼠胸膈膜剖开，摘取心脏，用生理盐水反复冲洗后，切取心尖处约四分之一置于中性甲醛溶液中固定(其余放入冻存管中保存备用于相关蛋白和mRNA的检测)24 h，24 h后取出用石蜡包埋，切片、HE染色即可。

1.2.8 免疫组化方法检测大鼠心肌Caspase-8、Bcl-2蛋白的表达 免疫组化法检测大鼠心肌Caspase-8、Bcl-2蛋白表达和分布时所用切片也为上述所得的石蜡切片。石蜡切片得到后使用二甲苯脱蜡、梯度乙醇冲洗后使其水化，之后用枸橼酸盐缓冲液修复抗原，3%过氧化氢促使心脏切片中残留的内源性过氧化物酶活性阻断，上述完成后用蒸馏水洗涤，加入一抗孵育、洗涤、加入二抗。孵育洗涤、DAB显色、苏木素复染、脱水、透明、封片即完成。

1.2.9 Western印迹检测蛋白表达 准确取1 g心脏组织，用组织裂解液和总蛋白提取液将组织充分的研磨裂解，后采用冷冻离心机4 ℃ 12 000 r/min离心5 min，提取上清液用BCA试剂盒对其进行定量后，调平置于低温冰箱中保存，检测时使用10%的ADS-PAGE凝胶电泳中电泳即可，电泳完成后转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脱脂奶粉封闭2 h后洗涤3次，之后加入相应一抗过夜后洗涤3次，加入对应二抗孵育2 h后洗涤3次，电致化学发光(ECL)发光试剂后曝光压片、显影定影、扫描仪扫描图片后采用Image J计算每个条带的荧光强度值，每组实验重复3次，结果以测定蛋白的荧光强度值/β-actin的荧光强度值比较即可。

1.2.10 实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测 mRNA表达 每组精密称取100 mg心脏组织，采用一步法提取总RNA并纯化，电泳确定条带后定量调平，每组各取2 μg进行逆转录合成cDNA，行qRT-PCR，比较以β-actin为内参照。引物序列设计为：TNF-α上游引物为5′-TCTCATTCCTGCTTGTGGC-3′，下游引物为5′-GCT GGCCCACTAGTTGGTT-3′；NT-proBNP上游引物为5′-ATGAAATATACAAGTTATATG-3′，下 游 引 物 为5′TTACTGGGATGCTCTTCGAC-3′；β-actin上游引物为5′-TCATGAAGT GTGACGTTGACATCCGTAAAG-3′，下游引物为3′- CCTAGAAGCATTTGCGGTGCA CGATGGAGG-5′，用2-ΔΔCt测定的数值比较并分析各组大鼠心脏组织中TNF-α、NT-proBNP的mRNA相对表达量。

2 结 果

2.1 大鼠一般情况 正常组大鼠日常活动、饮水和进食均正常，同时毛色发白没有粘连；模型组大鼠则出现典型的心肌损害症状，主要表现为精神萎靡，饮水量、进食量均明显降低，日常蜷卧于角落；苦瓜总皂苷低、中、高剂量治疗组上述症状较模型组明显轻。

2.2 各组大鼠心功能指标比较(见表1)

表1 大鼠心功能指标比较(±s)

注：1 mmHg=0.133 kPa，与正常组比较，1)P<0.05；与模型组比较，2)P<0.05

2.3 各组大鼠炎性因子TNF-α、IL-6水平比较(见表2)

2.4 各组大鼠HE染色结果比较 大鼠心脏组织HE染色可见，正常组大鼠心肌细胞排列整齐，细胞质和细胞间质没有明显的膨大；而模型组则有明显的心肌受损，细胞排列紊乱，同时细胞核大小不均一，部分细胞核固缩；苦瓜总皂苷低、中、高剂量治疗组心肌组织较模型组均有不同程度的改善。详见图1。

表2 各组大鼠炎性因子TNF-α、IL-6水平比较(±s) pg/mL

与正常组比较，1)P<0.05；与模型组比较，2)P<0.05

2.5 各组大鼠Bcl-2、Caspase-8表达特点 正常组大鼠心肌细胞中仅有少量Bcl-2、Caspase-8被标记，同时其表达分布均匀；而模型组Bcl-2分泌并没有明显增加，Caspase-8分泌则明显增加；苦瓜总皂苷低、中、高剂量治疗组Bcl-2表达较模型组分泌明显增加，同时随着给药剂量的增加，Caspase-8的分泌呈明显降低趋势。详见图2。

2.6 各组大鼠Bcl-2、Caspase-8蛋白表达水平比较 与正常组比较，模型组大鼠心肌组织中Bcl-2蛋白表达明显下降(P<0.05)，Caspase-8 蛋白表达明显升高(P<0.05)；与模型组比较，苦瓜总皂苷低、中、高剂量治疗组Bcl-2蛋白表达逐渐升高，且中、高剂量组明显高于正常组，差异均有统计学意义(P<0.05)。苦瓜总皂苷低、中、高剂量组Caspase-8蛋白表达较模型组明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见图3、表3。

表3 各组大鼠心肌组织Bcl-2、Caspase-8蛋白的相对表达量比较(±s)

组别只数Bcl-2Caspase-8正常组 121.14±0.24 0.42±0.13 模型组 90.57±0.341)2.12±0.161)苦瓜总皂苷低剂量组101.19±0.282)1.76±0.211)2)苦瓜总皂苷中剂量组101.37±0.271)2)1.43±0.161)2)苦瓜总皂苷高剂量组111.55±0.301)2)0.72±0.171)2)

与正常组比较，1)P<0.05；与模型组比较，2)P<0.05

2.7 各组大鼠Bcl-2、Caspase-8 mRNA表达水平比较 与正常组比较，模型组大鼠心肌组织中Bcl-2 mRNA表达明显下降(P<0.05)，Caspase-8 mRNA表达明显升高(P<0.05)；与模型组比较，苦瓜总皂苷低、中、高剂量组Bcl-2 mRNA表达逐渐升高，且均明显高于正常组，差异均有统计学意义(P<0.05)；Caspase-8 mRNA表达则明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表4。

表4 各组大鼠心肌组织Bcl-2、Caspase-8 mRNA表达水平比较(±s)

与正常组比较，1)P<0.05；与模型组比较，2)P<0.05

3 讨 论

慢性心力衰竭大鼠的造模国内外均有大量的研究，目前比较流行的主要有结扎左冠状动脉法、主动脉缩窄法以及阿霉素或去甲肾上腺素等药物促成法[7-10]。但在实际应用过程中发现结扎左冠状动脉和主动脉缩窄法等虽然可以较好地模拟人体的慢性心力衰竭过程，但是其操作方法难度较大，动物死亡率也较高。相对而言，阿霉素或者去甲肾上腺素则简单实用，因此，在基础医学领域较为常用，其中采用去甲肾上腺素可以准确地模拟肾心损伤模型，因此更为常用。有研究显示采用去甲肾上腺素制备的模型其心肌病理学、心肌酶谱、相关激素水平以及血流动力学更接近于人体，因此，将本模型用于药理学研究可以较好地评价药物药理学和药效学[11]。本研究采用盐酸异丙肾上腺素注射建立心力衰竭模型，造模中可见大鼠在注射盐酸异丙肾上腺素后表现有明显的精神萎靡，活动量降低，鼻腔出血，饮食量降低，蜷卧，气喘，毛发疏松且无光泽等。此外，在造模结束后对大鼠行血流动力学检查，可见大鼠+dp/dtmax明显降低，提示采用本方法所构建的心力衰竭模型很好地模拟了人体心力衰竭的特点，为苦瓜总皂苷的开发奠定了较好的基础。

目前的研究认为慢性心力衰竭的危害依然是凋亡，凋亡简单来说就是细胞的生理性死亡，其本来是维持机体正常新陈代谢的一种正常的过程，但是当受到一些外在或内在因素刺激时凋亡会给机体带来不可避免的损伤[12]，而在凋亡发生过程中，Caspase家族和Bcl-2家族蛋白在其中发挥重要的作用，在Caspase家族蛋白中，Caspase -8属于上游激活蛋白，其激活可以诱导下联其他Caspase家族蛋白(Caspase-3、Caspase-6及Caspase-9等)的激活，最终促进凋亡的发生。Bcl-2家族蛋白则根据其功能的不同分为两大类，分别为抗凋亡相关蛋白(Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w和Mcl-1)和促进凋亡相关蛋白(Bax、Bak、Bad和Bid)。在体内Bcl-2除可以和Bax结合形成共聚体来发挥抗凋亡作用外，还可以抑制Caspase家族蛋白的激活，因此，在凋亡中具有十分重要的地位[13-15]。

中医学认为苦瓜气味苦、无毒、性寒，主要入心、脾、肝、肺经，有清热祛暑、明目解毒、利尿凉血、解劳清心、益气壮阳之功效；苦瓜总皂苷是苦瓜中提取的一类皂苷类化合物。2007年柴瑞华等[16]研究报道苦瓜总皂苷可以明显降低2型糖尿病动物模型的血糖。莫灼康等[17]研究报道，苦瓜总皂苷对高血脂动物模型具有很好的调节作用。关于苦瓜总皂苷对心肌的作用也有报道，如朱定君等[18-19]研究报道，苦瓜总皂苷对糖尿病心肌损伤大鼠凋亡具有明显的抑制作用，且对心肌损伤大鼠金属基质蛋白酶也有很好的调节作用。但目前关于苦瓜总皂苷用于心力衰竭的研究报道较少，因此，本研究采用苦瓜总皂苷治疗慢性心力衰竭大鼠，结果发现苦瓜总皂苷治疗8周可以明显改善慢性心力衰竭大鼠的怠倦活动状态，改善大鼠心脏血流动力学指数，降低大鼠血清炎性因子，提示苦瓜总皂苷对慢性心力衰竭大鼠日常精神状态及心功能的改善具有积极的意义。此外，苦瓜总皂苷能够降低Caspase-8蛋白和mRNA表达，提高Bcl-2蛋白和mRNA表达，提示苦瓜总皂苷可以延缓心肌凋亡，进而对受损的心肌起到很好的保护作用。

本研究采用苦瓜总皂苷治疗盐酸异丙肾上腺素所致的心力衰竭大鼠，可以明显改善心肌组织中Caspase-8、Bcl-2蛋白和mRNA的表达，此外还可以降低炎症反应，保护心脏。