囊胚发育速度及形态学评分对冻融胚胎移植周期单囊胚移植结局的影响

张怡，严思思，丁锦丽，杨菁

(武汉大学人民医院生殖医学中心，湖北省辅助生殖与胚胎发育医学临床研究中心，武汉 430060)

随着培养体系的改善，囊胚移植逐渐得到广泛应用，与卵裂期胚胎移植相比，囊胚移植有利于筛选发育潜能更佳的胚胎，移植后着床及活产率更高[1]。而单囊胚移植因可保证与双囊胚移植相近的成功率并可降低多胎妊娠率、早产率等并发症而被越来越多的中心所接受[2-3]。挑选一个发育潜能良好的囊胚是选择性单囊胚移植成功的关键因素之一，但目前预测囊胚的发育潜能主要依据囊胚的发育速度及形态学评分，其选择的标准尚存在争议[4-5]，而关于D5及D6日囊胚移植成功率的差异，以及内细胞团和滋养层细胞与妊娠结局的关系并无明确答案。本研究通过回顾性分析本中心近2年来行冻融胚胎移植(FET)周期选择性单囊胚移植的患者资料，综合分析比较囊胚发育速度及形态学评分对移植结局的影响，以探讨单囊胚移植的优化策略。

资料与方法

一、研究对象

选取2016年1月至2018年6月在武汉大学人民医院生殖医学中心行FET周期单囊胚移植的患者。排除年龄>35岁、内膜转化日子宫内膜厚度<7 mm及行PGD/PGS者。按照上述标准共纳入296个周期。

二、方法

1.囊胚培养及评分：体外受精第3日，将移植及冷冻后剩余胚胎逐一转移至囊胚培养液，在37℃、6% CO2培养箱中继续培养，于受精后第5及6日观察胚胎，按照Gardner评分系统对囊胚进行评级。优质囊胚的标准定义为3期及3期以上、内细胞团(ICM)及滋养层(TE)细胞均为B级及以上者；可利用胚胎定义为3期以上、ICM和TE评分不同时为C者。选取优质胚胎及可利用胚胎进行冷冻，用于FET周期囊胚移植。

2.囊胚冷冻与复苏：囊胚冷冻前行激光皱缩，2 h内进行玻璃化冷冻。冷冻/解冻液购自日本加藤公司，室温下将囊胚放入平衡液中5 min，然后将囊胚转移至玻璃化冷冻液中，60 s内将囊胚放置于冷冻载杆上，迅速浸入液氮中保存。解冻时将载杆浸入37℃解冻液中，1 min内将胚胎转移至稀释液中作用3 min，后依次在洗涤液1、2中作用5 min，将胚胎转移至囊胚培养液中，37℃、6%CO2环境中培养，等待囊胚移植。

3.内膜准备与囊胚移植：采用人工或自然周期准备内膜，囊胚移植在腹部超声引导下进行。移植后第12日查血HCG，移植后30 d行B超检查，见宫内孕囊者为临床妊娠。

三、观察指标

患者一般资料；临床妊娠率(临床妊娠例数占总FET周期数的百分比)；孕早期流产率(孕3月内流产例数占妊娠例数百分比)；继续妊娠率(孕3月后妊娠例数占FET周期数的百分比)。并对FET周期单囊胚移植妊娠结局影响因素进行二分类Logistic回归分析。

四、统计分析

采用SPSS 20.0软件进行统计学分析。均数比较采用t检验或方差分析，率的比较采用卡方检验，并采用二分类Logistic回归分析对相关参数对临床妊娠率的影响进行分析。P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、一般资料

本研究共纳入296个周期。接受囊胚移植患者平均年龄为(32.6±5.1)岁，囊胚复苏存活率为100%，临床妊娠124例(41.9%)，孕早期流产15例(12.1%)，继续妊娠109例(36.8%)；其中，多胎妊娠2例(0.7%)、异位妊娠3例(1.0%)。

二、囊胚发育速度对妊娠结局的影响

在所纳入移植周期中，130例(43.6%)患者移植第5日(D5)囊胚，166例(56.4%)患者移植第6日(D6)囊胚。D5组与D6组患者年龄、内膜准备方案构成及内膜厚度比较均无统计学差异(P>0.05)。其中D5组优质囊胚62例(47.7%)，D6组优质囊胚49例(29.5%)，D5组优质囊胚比例显著高于D6组(P<0.05)。

移植优质囊胚者，D6组孕早期流产率、临床妊娠率、继续妊娠率均稍高于D5组，但无统计学差异(P>0.05)；移植非优质囊胚者，D5组临床妊娠率及继续妊娠率稍高于D6组，但亦无统计学差异(P>0.05)(表1)。

表1 不同发育速度单囊胚移植结局比较[n(%)]

三、形态学评分对临床妊娠的影响

根据ICM及TE评分将单囊胚移植患者分为优质囊胚组及非优质囊胚组，其中非优质囊胚组进一步细分为ICM/TE评分B/C及C/B两个亚组。三组间患者年龄、内膜准备方案构成及内膜厚度均无统计学差异(P>0.05)。

对于移植非优质囊胚者而言，ICM/TE评分为C/B者临床妊娠率及继续妊娠率均显著低于优质囊胚组(P<0.05)，早期流产率升高，但无统计学差异(P>0.05)；而B/C组临床妊娠率与移植优质囊胚者相比无统计学差异(P>0.05)(表2)。

表2 形态学评分对单囊胚移植结局的影响[n(%)]

注：与优质囊胚组比较，*P<0.05

四、临床妊娠影响因素分析

采用二分类Logistic回归分析。在校正可能的混杂因素影响之后，ICM评分对临床妊娠结局存在显著影响[OR=0.12，95%CI(0.03，0.56)，P=0.007]，而囊胚TE评分、发育速度等则无显著影响(P>0.05)(表3)。

表3 单囊胚FET临床妊娠影响因素分析

讨 论

本研究主要分析了不同发育速度及不同质量的囊胚FET临床结局的差异。研究发现，囊胚发育速度与FET临床妊娠率无显著相关性，无论是移植优质囊胚还是非优质囊胚，D5日与D6日单囊胚移植者临床妊娠率、孕早期流产率及继续妊娠率均无显著差异。Logistic回归分析结果也显示临床妊娠结局与胚胎发育速度无关。然而，当对ICM评分不同的非优质囊胚进行亚组分析时发现，ICM评分为C的非优质囊胚临床妊娠率及继续妊娠率均显著低于优质囊胚，孕早期流产率也有增加的趋势；而ICM评分为B级的非优质囊胚临床妊娠率与优质囊胚相当，这与Logistic回归分析结果相一致——ICM评分与临床妊娠结局相关，而TE评分则无此影响。在Logistic回归分析模型中，为排除其他混杂因素的影响，亦将囊胚扩张程度、取卵时患者年龄、FET周期内膜准备方案及内膜厚度纳入模型中，并未发现上述变量与妊娠结局相关，表明内细胞团评分是影响单囊胚移植妊娠结局的独立因素。

囊胚发育速度被认为是反映胚胎质量的指标之一。曾有研究表明，在鲜胚移植周期中，D5囊胚移植临床妊娠率高于D6囊胚，但目前尚不清楚这一结果究竟与囊胚发育潜能还是子宫内膜容受性降低有关。FET周期降低了子宫内膜容受性对移植结局的影响，可更好地判断囊胚发育速度与囊胚发育潜能的关系，但D5与D6囊胚移植结局是否存在差异仍有分歧。Irani等[6]回顾性分析了701名活检后移植行整倍体单囊胚移植周期的妊娠结局，D5囊胚着床率及活产率均高于D6囊胚。有研究则表明，对于移植优质囊胚者，D5及D6囊胚可获得相近的妊娠率及着床率，但对于移植非优质囊胚者，移植D5囊胚结局明显优于D6囊胚，这可能与D6囊胚非整倍体率发生率相对较高有关[7-9]。另有研究发现，囊胚复苏周期移植成功率主要与囊胚质量有关，而与囊胚发育天数无关[10]。在本研究中，对于移植优质单囊胚患者，D5及D6临床妊娠结局无显著差异；而对于移植非优质单囊胚者，尽管D5囊胚临床妊娠率较D6囊胚无显著差异，但有升高的趋势。尚有待进一步扩大样本量进行分析。

有关囊胚形态学评分对囊胚发育潜能的预测价值目前也存在众多争议。近年来研究表明，囊胚滋养层细胞在预测妊娠结局方面效果更佳，与持续妊娠率密切相关[11]。甄璟然等[12]对141个单囊胚复苏移植周期分析发现，在女性年龄、ICM质量及TE质量三个变量中，TE评分对临床妊娠有最大预测价值；Honnma等[13]及国内学者陈清汾等[14]也发现，对于非优质胚胎而言，滋养层细胞形态学评分低者妊娠率降低、流产率升高。这可能与囊胚滋养层的功能有关——滋养层细胞在胚胎着床过程中是分化发育成胎盘的部分，与胚胎着床相关[15]。但亦有研究表明，ICM评分越高，整倍体囊胚所占比例越低，与囊胚发育潜能相关[16-17]。在本研究，并未发现TE评分与移植结局之间的显著关联，反之，对于非优质囊胚来说，ICM评分为C者临床妊娠率及继续妊娠率均低于移植优质囊胚者，间接表明相较于滋养层而言，内细胞团质量是决定胚胎发育潜能、影响临床妊娠率的重要因素。为排除混杂因素对临床妊娠结局的判断，我们在Logistic回归分析中同时纳入年龄、内膜准备方案、内膜厚度等变量，并未发现上述因素对妊娠结局的影响。但有研究发现，高龄女性(≥39岁)囊胚移植成功率随之下降[10]，这可能与年龄相关的非整倍体率上升有关。而囊胚发育天数、ICM评分及TE评分这三个变量中，仅ICM评分对妊娠结局存在影响，表明ICM是决定囊胚发育潜能的主要因素。

然而，本实验仍存在一定的缺陷。首先，所纳入的单囊胚移植周期数量较少，对于组间比较差异无显著性的结果，仍需要扩大样本量进行深入研究；此外，因部分病例为近期移植患者，仅能追踪到移植后3个月结局，故仅对临床妊娠率、孕早期流产率及继续妊娠率进行分析，而活产结局仍有待进一步随访。

综上所述，对于优质囊胚而言，囊胚发育速度对FET周期单囊胚移植结局影响不大；但对于非优质囊胚而言，囊胚发育速度的影响仍有待进一步探索，在本研究中，尽管D6囊胚与D5囊胚相比临床妊娠率无统计学差异，但仍有一定程度的降低。故在进行胚胎移植时，可倾向于优先选择内细胞团评分较高的D5囊胚，或将有可能提高临床妊娠率。