液氮蒸汽法冷冻精液前不同平衡条件对复苏效果的影响

马静，田慧艳，韩瑞钰，王树松，田朝辉，马琳，赵邦荣

(河北省计划生育科学技术研究院，国家卫计委计划生育与优生重点实验室，石家庄 050071)

人类精子的冷冻保存作为辅助生殖技术发展的基础，对不育症治疗、优生优育以及生殖保险等具有重要意义[1]。目前人类精子冷冻方法较多，常用的有程序降温法和液氮熏蒸法。程序降温法冷冻自动化程度高，可以精准地控制降温速率，但需配备仪器，且适合批量冷冻。液氮蒸汽熏蒸法冷冻，由于简单快捷，节省液氮消耗，而且不需要昂贵的仪器，可以同时接受多批次大量冷冻标本，被大多数精子库所采用[2]。但液氮蒸汽法冷冻由于冷冻保护剂和冷冻条件的差异，冷冻条件仍需进一步优化，以提高精子的冷冻复苏率。

本研究选择在低温(4℃～6℃)和室温(20℃～25℃)两个不同温度环境下进行精子冷冻前的平衡。首先，在同一温度下，比较不同的平衡时长，筛选出该平衡温度下的最佳平衡时长。然后再对两个不同平衡温度下各自的最佳平衡时长效果进行比较，找出最佳的精子冷冻前平衡处理条件。

一、资料和方法

1.研究对象：精液标本来源于2016年1月至2017年1月到河北省人类精子库捐精且体检合格的筛查期志愿者。年龄20～40岁，禁欲2～7 d，通过手淫方式取精。精液量≥3 ml(因实验分组多，需要标本液量较大)，精子浓度≥60×106/ml，前向运动精子(PR)百分率≥50%。

本研究征得志愿者的知情同意，并签署了知情同意书。

2.精子冷冻保护剂与仪器：甘油-卵黄-柠檬酸盐(GEYC)冷冻保护剂由精子库实验室人员参照世界卫生组织《人类精液检查与处理实验室手册》(第五版)[3]自行配制。精子冷冻储存容器选用德国Greiner Bio-One生产的2 ml低温冻存管。

3.精液标本的冷冻与复苏：预先将冷冻保护液复温至室温，分装入冷冻管中，每管0.3 ml。待每份精液标本完全液化后，在室温环境中将0.6 ml精液加入预先装好保护液的冷冻管中(冷冻保护液与精液比例为1∶2)，颠倒混匀(此标本以下称为精液冷冻标本)。按照组别进行冷冻前的平衡处理后，将精液冷冻标本悬吊于液氮面上1 cm处 15 min，然后投入液氮中。精液冷冻至少24 h后复苏，从液氮罐中取出冷冻标本，置于37℃水浴箱中复温6 min。

4.实验分组与处理：首先选择20份精液标本进入室温组，每份精液分为4份，分别与冷冻保护液混匀后，分为4组：A组为对照组，精液冷冻标本冷冻前不进行平衡处理(立即置于液氮上方进行冷冻)；B组精液冷冻标本置于室温5 min；C组精液冷冻标本置于室温10 min；D组精液冷冻标本置于室温15 min。实验组在平衡后、冷冻前，再次观察并记录精子的活力。然后不同组别以同样的方法进行液氮蒸汽熏蒸法冷冻，冷冻复苏后检测各组精子活力。

然后再选择20份精液标本进入低温组(冰箱冷藏室)，每份精液分为4份，分别与冷冻保护液混匀后，分为4组：甲组为对照组，精液冷冻标本冷冻前不进行平衡处理(立即置于液氮上方进行冷冻)；乙组精液冷冻标本置于低温5 min；丙组精液冷冻标本置于低温10 min；丁组精液冷冻标本置于低温 20 min。实验组在平衡后、冷冻前，再次观察并记录精子的活力。然后以同样的方法进行液氮蒸汽冷冻，冷冻复苏后检测各组精子活力。

最后，以上两个组别分别筛选出在各自平衡温度下的最佳平衡时长，再选择20份精液标本，每份精液分为3份，分别与冷冻保护液混匀后，分为3组：对照组(不进行冷冻前平衡处理)、室温组和低温组，后两组分别采用前面实验确定的最佳平衡时长。冷冻复苏后检测各组精子活力。

5.精液分析：每份精液标本分别在液化后、平衡后(冷冻前)、冷冻复苏后，按照世界卫生组织《人类精液检查与处理实验室手册》第5版[3]推荐的标准程序，进行活力分析。吸取10 μl精液标本，滴加在Makler精子计数板上，每次分析至少评估200条以上精子，记录前向运动精子(PR)百分率。每份标本分析两次，两次结果满足95%可信区间检验，取平均值报告结果。计算冷冻复苏率，即(冷冻后PR百分率/冷冻前PR百分率)×100% 。

二、结果

1.室温条件下不同平衡时长组别的精子活力及冷冻复苏率的比较：3个实验组在室温条件下不同时长平衡后，B组活力较原液活力升高，C组和D组活力较精液原液活力下降，均存在显著性差异(P<0.05)。冷冻复苏后的复苏率，B组显著高于A组、C组和D组，D组显著低于A组(P<0.05)；A组和C组复苏率无显著性差异(P>0.05)(表1)。

表1 室温条件下各组平衡后和复苏后活力(PR%)及复苏率的比较

注：与同组原活力比较，*P<0.05；与A、C、D组复苏率比较，△P<0.05；与A组复苏率比较，#P<0.05

2.低温条件下不同平衡时长组别的精子活力及冷冻复苏率的比较：3个实验组在低温条件下不同时长平衡后，丁组精子活力较原液下降，且存在显著性差异(P<0.05)，其余各组活力较原活力无显著性差异(P>0.05)。在冷冻复苏后各组的复苏率，丙组显著高于其他各组(P<0.05)；甲、乙、丁3组组间比较均无显著性差异(P>0.05)(表2)。

3.室温和低温最佳平衡时长冷冻复苏率比较：室温最佳组(平衡5 min)与低温最佳组(平衡10 min)冷冻复苏率比较，无显著性差异(P>0.05)，但2组复苏率均比对照组(不平衡直接冷冻)冷冻复苏率高，且存在显著性差异(P<0.05)(表3)。

表2 低温条件下各组平衡后和复苏后活力(PR%)及复苏率的比较

注：与同组原活力比较，*P<0.05；与其他各组复苏率比较，△P<0.05

表3 室温最佳组与低温最佳组冷冻复苏后活力(PR%)及复苏率的比较

注：与对照组比较，*P<0.05

三、讨论

精子在冷冻和解冻过程中，由于细胞内外冰晶的形成、渗透压失衡、低温损伤、活性氧的产生等因素，大量精子在复苏后产生结构和功能的损伤，失去活力[4-5]。精子细胞膜上胆固醇、磷脂以及高密度脂肪酸含量较高，使得人类精子与其他细胞相比，对低温有较强的耐受性[6-7]。因此，多数研究认为冰晶的机械损伤是影响冷冻后复苏的主要因素[8]。使用合适的冷冻保护剂及控制冷冻和解冻的速率，可减少细胞内冰晶的形成[9-10]。甘油-卵黄-柠檬酸钠(GEYC)是目前使用较多的甘油复合型精子冷冻保护剂。甘油是一种可渗透性的冷冻保护剂，能很快进入精子内，使其脱水，减少或防止精子内冰晶形成，稳定细胞内外液中电解质浓度。但同时，甘油也会产生一定的渗透毒性作用[11-12]，引起精子超微结构的明显损伤，精子运动能力发生变化，受精能力下降。

精液冷冻前的平衡温度和时长对冷冻效果的影响容易被大家所忽视。本研究比较了冷冻前不同的平衡温度与时长对解冻后的精子活力的影响。通过参考国内相关研究的实验条件[13-14]，确定本研究分析比较常用的两个环境温度，即室温(20℃～25℃)和低温(冰箱冷藏室4℃～6℃)。通过预实验确定各温度环境下平衡时长的组别。结果显示，在室温环境下，5 min的平衡时长可达到相对较高的复苏率；在低温环境下，平衡10 min的时长可达到相对较高的复苏率。室温5 min的平衡时长与低温10 min的平衡时长，复苏后的效果相似。在不同的温度环境下，选择合适的平衡时长，既保证了甘油能够充分渗透入精子细胞内发挥作用[4，15]，又减少了甘油对精子的毒性影响。

在精液与保护液混合并平衡一段时长后，在冷冻前，我们对精子活力的观察也证实了甘油的毒性作用，这与Isachenko等[16]的研究趋势一致。在室温平衡5 min时精子活力略有上升，在室温平衡时长达到10 min、低温平衡时长达到20 min时，精子的活力都会较添加冷冻保护液之前有所下降。分析原因，可能是因为在不同的温度环境下，甘油渗透入精子细胞内的速率不同。温度越高，渗透越快。同时时间越长，甘油所产生的毒性也越大，首先的表现就是精子活力的降低。

本研究结果支持王亚楠等[13]的4℃平衡10 min优于室温平衡10 min的研究结论，且进一步表明室温平衡5 min与4℃平衡10 min的复苏效果相当，且不需要低温冷藏设备，更简单、快捷。该平衡条件不仅适合于一步熏蒸器冷冻精液，对于多数生殖中心和精子库使用液氮罐内悬吊法冷冻也适用。

精子冷冻技术作为辅助生殖技术的基础，其条件的优化与改进，对于男性生育力的保存尤为重要。对于多数精子库和生殖中心实验室常用的液氮熏蒸法冷冻精液，冷冻前在常温下平衡5 min比低温平衡更为简单，便于实施。