结直肠癌免疫治疗的研究进展及临床现状

邓敏,白杨,孙梦晗,王世豪

结直肠癌(colorectal cancer，CRC)在我国各类恶性肿瘤中发病率中居3～5位[1]，世界范围内CRC预计新增136万新发病例和69万死亡病例，CRC患者在确诊和后续治疗中超过一半容易发生复发或远处转移。近年来，随着肿瘤免疫学的快速发展，肿瘤免疫疗法取得了重大突破，相关药物也已获得了上市许可[2-5]。在CRC中，多种免疫疗法也开展了相关的临床试验，主要包括瘤疫苗、过继T细胞疗法、免疫检查点抑制剂及联合治疗。本文将重点介绍现有CRC免疫疗法的相关进展。

1 肿瘤疫苗

肿瘤疫苗是指给机体输入各种具有抗原性的疫苗后刺激机体免疫系统产生的具有抗肿瘤免疫应答反应的疗法，具有抗原特异性。肿瘤疫苗的主要类型有肿瘤抗原的多肽疫苗、病毒或细菌载体疫苗、核酸疫苗及树突状细胞疫苗等。在多个临床试验中，由于抗原选择不佳或肿瘤微环境等因素影响，使现有肿瘤疫苗未能取得令人满意的临床效果。肿瘤疫苗主要包括DC疫苗和OncoVAX 疫苗。

1.1 DC疫苗

抗原提呈细胞DC能诱导出特异性的T细胞反应，可将蛋白、抗原肽、病毒重组肿瘤抗原以及DNA或mRNA产物装载在DC上，从而形成DC疫苗[6]。由于大部分结肠癌可表达癌胚抗原(carcino-embryonic antigen，CEA)，早期的临床试验将CEA的mRNA产物或CEA肽装载于DC上的疫苗应用于CRC患者，结果显示患者疫苗的耐受性良好，但肿瘤治疗效果欠佳[7]。疫苗质量的控制、靶点的特异性及DC注射后不能有效回到淋巴器官等是DC疫苗的效果不理想的主要原因。靶向内源性DC(免疫检查点抑制剂结合DC进行疫苗的设计)是DC疫苗未来发展的方向。

1.2 OncoVAX 疫苗

OncoVAX疫苗是一种利用CRC患者术后自身的癌症细胞作为免疫刺激引发抗肿瘤免疫反应，这种特异性疫苗由具有代谢活性、无菌、非致瘤性的自体癌症细胞组成或结合新鲜冰冻的卡介苗(BCG)作为佐剂。一项Ⅲ期临床研究显示，术后予以OncoVAX疫苗治疗的患者肿瘤复发率比仅做手术治疗的患者低，并且无复发生存期较仅做手术治疗的患者更长。但是总体的生存率无明显差异并且OncoVAX疫苗仅对Ⅱ期CRC患者显示有效[8]。后续研究表明，OncoVAX疫苗可延长Ⅱ期CRC患者无复发间隔期、总生存期和无复发生存期[9]。近期的荟萃分析也表明CRC患者术后联合OncoVAX疫苗治疗科有较好的临床效益[10]。

2 过继T细胞疗法

过继T细胞疗法(adoptive T cell therapy，ACT)是指收集自体或异体的免疫细胞在体外扩增，再将T淋巴细胞回输入患者体内，使之直接杀灭肿瘤细胞或调动机体的免疫功能抑制肿瘤。ACT包括肿瘤浸润细胞(tumor infiltrating lymphocyte, TIL)和嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor, CAR)T细胞疗法。

2.1 肿瘤浸润细胞(TIL)T细胞疗法

TIL疗法是指从肿瘤组织中分离出具有较强抗肿瘤效应的CD4+、CD8+细胞，在体外经白介素2(IL-2)的刺激、活化、扩增后回输于临床肿瘤患者的细胞进行治疗。2016年，Tran E等人收集了1例Kras基因突变的肺转移CRC患者的TILs，体外选择高特异性靶向Kras的CD8+T细胞，扩增后输注回患者体内。结果显示该患者7处肺转移瘤缩小，第9个月时仅有1个病变进展，该病变切除后患者3个月内病变无进展[11]。

2.2 嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法

在体外将肿瘤靶向T细胞进行基因工程处理后，使其表面表达能够识别特异性肿瘤抗原的特殊抗体，即CAR，同时在受体胞内段加上引起T细胞活化的信号传递区域，使表达CAR的T细胞识别并结合肿瘤抗原，从而攻击肿瘤细胞，这种方法称为CAR-T疗法[12]。大部分CRC均可表达CEA，故CEA可作为结直肠癌ACT治疗的一个靶点[13-15]。一项小型研究表明三例给予靶向CEA的CAR-T治疗的mCRC患者，三例患者血清CEA水平均下降，但均发生了严重结肠炎[13]，其中一例肝肺转移的CRC患者达到了客观缓解。另一项研究显示10例难治性mCRC患者输注CAR-T细胞治疗，7例患者4周内能保持病情平稳，2例患者肿瘤缩小。第30周时，仍有2例患者保持病情平稳，并且该研究中患者治疗耐受性良好，未出现结肠炎[15]。

目前，靶向CD19抗原的CAR-T细胞治疗已成功应用于B淋巴细胞瘤，并获得了FDA及EMA的批准[16-17]。而CAR-T疗法对实体瘤如结直肠癌的治疗许多方面(如细胞因子释放综合症、严重神经毒性、脱靶效应、体内持续时间短、复发率高等问题[18-19])仍有待研究。同时，ACT治疗也存在临床应用的可行性、患者可负担性、复杂的细胞操作等一系列挑战，ACT细胞治疗将会受到持续关注。

3 免疫检查点抑制剂治疗

免疫检查点抑制剂(Immune checkpoint inhibitors)对于多种癌症有治疗作用，包括黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾细胞癌及错配修复缺陷疾病等。根据肿瘤微环境可分为：错配修复功能缺陷或微卫星高度不稳定CRC及错配修复功能完整或微卫星低度不稳定或微卫星稳定(pMMR-MSI-L)CRC。目前单独使用免疫检查点抑制剂对dMMR-MSI-H的结直肠癌有效，而对pMMR-MSI-L的结直肠癌无效[20-21]。

2010-2013年的临床研究中结直肠癌还未分型，免疫检查点抑制剂在结直肠癌中取得了有限的临床效益。一项临床研究中，45例难治性CRC患者接受了抗CTLA4免疫球蛋白抗体-替西木单抗(tremelimumab)的治疗，结果仅有1例患者有部分反应，该患者结直肠癌分型未知[22]。另一项研究中，19例患者接受抗PD-1免疫球蛋白抗体-尼鲁单抗(Nivolumab)的治疗，最初患者均无反应，直到治疗的第21个月时有1例患者出现反应，并且经过再治疗后疗效持续了3年以上，该患者经过分析为dMMR-MSI-H结直肠癌[23]。

肿瘤微环境的发现促进了结直肠癌免疫治疗的发展。2015年Le DT等人[24]做的一项研究(NCT01876511)中，将抗PD-1免疫球蛋白抗体-派姆单抗(pembrolizumab)分别应用于dMMR-MSI-H的结直肠癌、pMMR-MSI-L的结直肠癌及dMMR-MSI-H非结直肠癌患者，结果显示10例dMMR-MSI-H结直肠癌患者中4例部分缓解，5例第20周时仍病情平稳，dMMR-MSI-H结直肠癌患者无进展生存期(progression-free survival, PFS)和总生存期(overall survival, OS)比pMMR-MSI-L的结直肠癌患者长。2016年美国临床肿瘤学会(ASCO)年会提出应用派姆单抗的28例dMMR-MSI-H结直肠癌患者中，反应率为50% [95%CI(31%～69%)]，疾病控制率为89%，61%的患者1年内病情无进展和66%的患者总生存期达1年，而18例pMMR-MSI-L的结直肠癌患者均无缓解。以上研究表明单独使用免疫检查点抑制剂仅对dMMR-MSI-H的结直肠癌有效，而对pMMR-MSI-L的结直肠癌无效。2017年Overman、Roelands及Andre等人[25-27]评估了尼鲁单抗(nivolumab)及尼鲁单抗结合抗CTLA4免疫球蛋白抗体-伊匹单抗(ipilimumab)对dMMR-MSI-H结直肠癌患者的疗效，随访1年发现69%单用尼鲁单抗患者疾病缓解大于12周，50% [95%CI(31%～69%)]的患者1年内病情无进展和73%的患者总生存期达1年，20%患者出现了3～4级免疫治疗相关副作用。联合使用尼鲁单抗及伊匹单抗患者客观缓解率为33%，52%患者病情平稳，32%患者出现了3～4级免疫治疗相关副作用。研究表明尽管联合使用尼鲁单抗及伊匹单抗较单用尼鲁单抗效果好但副作用强。在以上研究基础，美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration，FDA)分别于2017年5月、2017年7月批准了派姆单抗及尼鲁单抗作为dMMR-MSI-H 结直肠癌患者的二线治疗方案。但至今，免疫检查点抑制剂仍未获得欧洲药品管理局(European Medicines Agency, EMA)的批准。

目前，多项PD-1、PD-L1抑制剂治疗dMMR-MSI-H结直肠癌患者的临床研究试验仍在进行。2018年欧洲肿瘤内科学会(European Society for Medical Oncology, ESMO)评估了尼鲁单抗联合低剂量伊匹单抗治疗晚期dMMR-MSI-H结直肠癌患者的疗效及安全性[28]，报告显示入组45例患者中，随访13.8个月，客观缓解率为60%，疾病控制率为84%，77%的患者1年内病情无进展和83%的患者总生存期达1年，并且免疫治疗相关副作用达可接受范围。一项有关派姆单抗的Ⅲ期临床研究试验(NCT02997228)正在进行，截至2018年5月，共308名患者入组并将随机分配至派姆单抗治疗组及其他一线化疗组，首要终点为PFS和OS，次要终点为总体缓解率[29]。一项有关抗PD-L1免疫球蛋白抗体-阿特珠单抗(ateolizumab)的长期研究正在进行，该研究将347例结直肠癌患者随机分配至阿特珠单抗治疗组、其他一线化疗组(包括5-氟尿嘧啶、甲酰四氢叶酸+奥沙利铂+血管内皮生长因子)或二者联合治疗组，首要终点为PFS，次要终点为OS和客观缓解率[30]。

4 联合治疗

结直肠癌的免疫结合治疗方法是采用两种及两种以上治疗手段对患者进行治疗，目前主要研究的为两种手段联合治疗。联合治疗主要包括化学免疫疗法、放射免疫疗法、免疫检查点抑制剂联合抗血管内皮生长因子疗法、PD-L1单抗结合MEK抑制剂疗法、CEA-CTB双特异性抗体疗法及PD-L1单抗联合CTLA-4单抗疗法。

4.1 化学免疫疗法

化学免疫疗法是指化疗的基础上联合应用免疫治疗。化疗不仅可以杀死肿瘤细胞，还减少了免疫抑制细胞，如调节性T细胞，此外，淋巴细胞的减少刺激稳态T细胞增殖，这些都为肿瘤免疫治疗提供了良好的环境。化学免疫疗法已被广泛用于血液恶性肿瘤[31]。2008年Correale P[32]首次报道化学免疫疗法应用于人类CRC患者的临床试验，该试验中46名mCRC患者接受化疗药物治疗(吉西他滨、奥沙利铂、左旋氟苄酸及5-氟尿嘧啶)后，又接受了粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白介素-2(IL-2)治疗，结果显示6名患者总生存期和无进展生存期延长。并且这些患者体内Treg细胞减少，记忆T细胞和结直肠癌特性性细胞毒T细胞增加。该试验提示Treg细胞与接受化学免疫疗法的预后相关。2014年开展了一项化学免疫疗法多中心III期临床试验(GOLFIG试验)，试验结果显示化学免疫疗法组的患者总缓解率和无进展生存期优于对照组。但由于对照组患者数量不足，该研究已经停止[33]。2019年一项Ⅲ期随机临床试验(NCT02912559)招募了700例dMMR-MSI-H mRC患者，实验组予以FOLFOX方案+阿特珠单抗(atezolizumab，PD-1抑制剂)治疗6个月，再用阿特珠单抗单药治疗6个月。主要研究终点是无进展生存期，次要终点是总生存期和不良事件发生率[34]。因此，化学免疫疗法目前还未证实优于其他治疗CRC方法，但这些临床研究表明GOLFIG方案未来可能成为mCRC一线治疗方案。

4.2 放射免疫疗法

放射免疫疗法即是放射治疗联合免疫疗法。由于放疗辐射损伤细胞DNA，从而产生新抗原刺激大量T细胞增殖，可为免疫治疗提供一定环境基础[35]。2016年 Twyman-Saint Victor C等人[36]报道了一项研究(NCT02437071)，该研究中CRC患者予以派姆单抗结合射频消融治疗或结合外照射治疗，中期结果显示22名接受外照射治疗的患者中，有1例患者病情缓解。而接受射频消融的缓解均无缓解。研究证明了黑色素瘤患者予以放疗结合双免疫检查点阻断剂(抗CTLA-4和抗PD-L1)治疗后肿瘤消退。放疗结合双免疫检查点阻断剂(抗CTLA-4和抗PD-L1)治疗CRC患者目前仍在研究中(NCT03122509)[37]。

4.3 免疫检查点抑制剂联合抗血管内皮生长因子治疗pMMR-MSI-L CRC

一项联合使用贝伐珠单抗(bevacizumab，抗血管内皮生长细胞因子)和易普利姆单抗(ipilimumab，抗CTL-4抗体)治疗黑色素瘤患者的研究显示加入贝伐珠单抗可以增加CD8+T细胞浸润至肿瘤组织，该研究提示贝伐珠单抗具有一定的免疫调节功能[38]。2018年美国NCI开展了一项大型伞形研究(MODUL研究)，所有mCRC病人一线接受FOLFOX+贝伐珠单抗(Bev)治疗3～4个月，疾病无进展者行分子标志物检测，然后基于检测结果进入不同的维持治疗模式，有多个队列，其中队列2即是BRAF野生型患者，按1∶2接受氟化嘧啶(FP)+Bev对比FP/BEV+PD-L1单抗Atezo维持治疗。研究主要终点是PFS，假设是从FP/BEV组的7.5个月延长到FP/BEV/Atezo组的11.5个月，HR=0.65。队列2一共入组了445例，其中378例检测了MSI状态，98%(371例)为pMMR-MSI-L。中位随访18.7个月后，结果显示两组间PFS(7.39对比7.20个月，HR=0.96，P=0.727)和OS(21.9对比22.0月，HR=0.86，P=0.283)均无差异[39]。PD-L1单抗加入维持治疗并未给pMMR-MSI-L mCRC病人带来生存获益，安全性情况与既往的报道一致。

4.4 PD-L1单抗结合MEK抑制剂治疗pMMR-MSI-L CRC

临床前研究显示MEK抑制剂Cobimetinib(Cobi)可以阻断RAS-MAPK途径，上调癌细胞的MHCⅠ类抗原，诱导肿瘤内T细胞浸润，增强PD-L1单抗Atezolizumab(Atezo)的抗瘤活性[40- 41]。一项Ib临床试验(NCT01988896)将MEK抑制剂Cobimetinib(Cobi)结合PD-L1单抗Atezolizumab(Atezo)治疗23例CRC(其中22例为Kras突变)，初步结果显示17%的ORR(4例PR，5例SD)，其中4例PR患者中有3例被证实为pMMR-MSI-L CRC。2018年更新的研究结果显示84例入组患者，中位随访14.3个月后共有7例PS，其中3例为pMMR-MSI-L CRC，1例MSI-L，另外3例类型不明确。这些研究结果提示了MEK抑制剂联合抗PD-L1单抗在pMMR-MSI-L CRC患者中的潜在治疗价值，一项Ⅲ期临床研究IMblaze370(NCT02788279)将363例难治性pMMR-MSI-L 的mCRC患者按照2∶1∶1分配到Cobi+Atezo、Atezo单药和瑞戈非尼组，主要终点为OS优效性，即Cobi+Atezo优于对照组瑞戈非尼。最终，三组12个月的OS率分别为38.5%、27.2%和36.6%，中位OS分别为8.9、7.1和8.5个月，中位PFS分别为1.9、1.9和2.0个月，ORR分别为2.7%、2.2%和2.2%，结果显示OS结果并未达到主要研究终点，是一个阴性研究，显示MEK抑制剂并不能逆转pMMR-MSI-L mCRC对PD-L1单抗的耐药[42]。

4.5 CEA-CTB双特异性抗体治疗pMMR-MSI-L CRC

2017年ASCO大会提出了一个名为CEA-TCB免疫治疗新药，并报告了该药两项Ⅰ期临床试验结果(NCT02324257和NCT02650713，NCT02324257为单药试验，NCT02650713为联合atezo试验)。CEA-TCB全称为carcinoembryonic antigen CD3T-cell bispecific antibody, 癌胚抗原CD3T细胞双特异性抗体。其作用机制是招募并激活T细胞，通过释放细胞毒素颗粒，选择性杀死CEA高表达的肿瘤细胞。体外研究显示抗PD-L1(atezo)可以增强CEA-TCB的抗肿瘤活性。临床试验结果显示CEA-TCB在重度MSS mCRC患者中具有抗肿瘤活性，联合atezo之后活性增强，无论单药还是联合atezo，毒性反应均可控。CEA-TCB是首个T细胞双特异性抗体，并对多种表达CEA的固体瘤中有效，特别是对免疫检查点抑制剂无效的MSS CRC[43]。除了本身具有抗肿瘤活性，CEA-TCB还表现处与抗PD-L1治疗的协同效应，有望能逆转MSS CRC患者对免疫检查点抑制剂的耐药，这扩大了免疫治疗在CRC的应用。

4.6 PD-L1单抗联合CTLA-4单抗治疗CRC

2018年ESMO会议首次提出将PD-1单抗(nivolumab)结合CTLA-4单抗(ipilimumab)治疗可切除的早期CRC研究，该研究的主要终点是安全性和可行性，次要终点包括病理学缓解。所有入组患者6周内行手术治疗，7例dMMR-MSI-H CRC患者均获得了病理缓解，其中4例(57%)完全缓解。8例pMMR-MSI-L CRC患者未见获得病理缓解，但不管是pMMR-MSI-L还是dMMR-MSI-H CRC患者均增加了T细胞的瘤内浸润[44]。2019 ASCO GI会议上报告了一项大型Ⅱ期临床研究(CCTG CO.26)，该研究使用PD-L1单抗Durvalumab(D)(阿斯利康公司开发的具有高亲和力的人源化IgG1抗体)并联合CTLA-4单抗tremelimumab(T)(阿斯利康公司开发的选择性全人源化IgG2抗体)治疗了180例难治性mCRC患者(其中98%为pMMR-MSI-L)，患者按2∶1随机分配到D+T组或者最佳支持治疗(BSC)组。前期治疗包括D 1 500 mg第1天和T 75 mg第1天，每28 d 1个疗程，共4个疗程，联合最佳支持治疗措施。主要研究终点为OS，假定OS从对照组的4.5个月延长到研究组的6.9个月，HR=0.65。CO.26研究达到主要终点，OS从4.1个月延长到6.6个月，未调整HR=0.70(95%CI0.53～0.92)，P=0.03。亚组分析显示各亚组间OS改善的趋势比较一致，包括PS状况、年龄、性别、原发瘤部位、RAS、BRAF及MSI基因状态；其他有效性结果包括DT组有1例客观缓解，DCR为23%；对照组无客观缓解，DCR 7%；两组间的PFS无差别。DT组所有患者均出现治疗毒性，3度以上毒性占64%，显著高于对照组的20%。该研究展示了免疫检查点抑制剂治疗pMMR-MSI-L型mCRC患者的有效性，能显著延长OS[45]。但双抗免疫治疗的毒性值得临床重视。

5 结语

综上所述，人类CRC免疫治疗发展数十年，免疫治疗方法不断发展，由DC疫苗到过继T细胞治疗再到免疫检查点抑制剂，最后又发展为联合治疗。目前，dMMR-MSI-H CRC患者的免疫治疗适应征进一步扩大，由转移性肿瘤的后线治疗拓展为一线治疗和早期阶段的新辅助治疗。联合免疫治疗有望能逆转MSS CRC患者对免疫检查点抑制剂的耐药，扩大免疫治疗在CRC的应用范围。但复杂的细胞操作、免疫微环境、免疫治疗的毒性反应等仍需进一步研究。