包虫病免疫及疫苗的研究进展

丁剑冰， 李玉娇， 张峰波

(新疆医科大学1基础医学院， 乌鲁木齐 830011; 2第一附属医院, 乌鲁木齐 830054;3省部共建中亚高发病成因与防治国家重点实验室， 乌鲁木齐 830011)

包虫病(Hydatidosis)是棘球绦虫的幼虫寄生于宿主体内引起的人兽共患寄生虫病，为我国优先防治的动物疫病之一[1]。包虫感染最重要的危害是导致肝脏的持续进行性损害，影响宿主的健康。在牧区，终末宿主犬类体内的虫卵污染草原和食物，能够导致中间宿主羊和人的大面积传播，对牧区人民的健康和经济发展造成影响。包虫病是世界范围的公共卫生问题之一，在牧业发达的国家如澳大利亚等国家流行，我国以偏远地区新疆、青海、内蒙等牧区最为严重，人群发病率可高达5%～10%[2]。包虫病的总体患病率为8.1%，其中细粒棘球绦虫(Echinococcosis granulosus，Eg)引起囊型包虫病(CE)的患病率为4.2%，多房棘球绦虫(Echinococcus multilocularis，Em)引起的泡型包虫病(AE)的患病率为3.9%，在中国约有5 000万人存在被感染的风险，目前已经有38万例包虫病患者。 新疆和青藏高原是畜牧业分布较广的区域，受文化、宗教和风俗的影响，包虫病的防治效果不显著。干扰包虫病的致病机制，或避免接触有传染性棘球绦虫的虫卵，或控制传染源和切断传播途径是预防棘球蚴病较为理想的措施。因此很有必要开展包虫病免疫机制研究，探寻包虫病的免疫治疗靶点，同时积极寻找有效的保护性抗原及抗原表位，开发研制有效疫苗，是广大牧区人民群众和当前西部大开发政策的迫切需要[3]。

1 包虫感染的免疫细胞和分子机制

棘球绦虫(Eg或Em)在长期的生活史中，进化出复杂的生活机制，维持其繁殖和生存[4]。包虫诱导机体产生多种调节蛋白，这些蛋白能够改变宿主的免疫功能，从而干扰机体针对寄生虫产生的固有免疫反应和获得性免疫反应，致使包虫逃避免疫防御在机体长期寄生。Eg和Em寄生于人体肝脏器官，通过诱导免疫抑制来逃避宿主的免疫杀伤作用，使虫体顺利生长，刺激肝脏细胞纤维化，形成病灶，比如包囊的产生，对肝脏组织造成不可逆的损伤[5]。

1.1固有免疫细胞在包虫感染中的作用机体抵御病原体入侵的第一道防线是固有免疫(非特异性免疫)，其中固有免疫细胞在机体抗包虫感染的免疫反应中发挥了重要的作用。包虫感染的免疫特点是早期Th1细胞漂移为晚期的Th2细胞为主的免疫作用，这种漂移与巨噬细胞和树突状细胞(抗原提呈细胞，APC)的功能变化有关。徐岩等[6]在研究Em慢性感染的进程中，发现泡球蚴感染模型的树突状细胞(Dendritic cell, DC)作为抗原提呈细胞，通过激活T细胞功能，参与机体抵抗泡球蚴的免疫活动。Em相关抗原会直接刺激并影响DC的分化模式和功能，AE感染早期表现为mDC增多，发挥主导作用，刺激机体大量分泌细胞因子γ-干扰素(IFN-γ)和IL-12，有利于诱导宿主体内Th1为主的免疫应答，参与抗泡球蚴寄生的过程。但在Em感染的中晚期，mDC减少及功能下降，宿主不能对Em产生有效的免疫应答，诱导了Em的免疫逃避机制，促进了AE的形成。单骄宇等[7]在研究中发现机体感染Eg后吲哚胺2,3-双加氧酶(indoleamin 2,3-dioxygenase，IDO)对体内DC的功能影响较大，与寄生虫的免疫逃避有关。IDO升高的免疫机制是下调DC抗原提呈能力，避免在免疫应答起始阶段对T细胞的有效激活，进而阻碍了机体抗感染的功能，为寄生虫逃离机体的免疫监视进入体内打开了通道。李莹莹等[8]在综述中总结HLA-G有通过抑制DC的成熟和自然杀伤细胞(Natural killer Cell， NK)的功能，不能有效启动特异性T细胞免疫应答，这一机制有利于Eg逃避宿主的免疫作用，引起寄生器官微环境免疫状态的一系列改变，甚至参与重要脏器的Eg囊性灶形成。在机体固有免疫应答中单核-巨噬细胞(Macrophage，Mo/Mφ) 不仅与免疫防御密切相关，也参与机体的炎症反应。检测CE患者肝脏病灶局部的免疫应答发现，在感染后抗原提呈细胞(APC)CD11b+Mφ和CD11c+DC表达的人类组织相容性复合物Ⅱ(MHCⅡ)下调明显，表明T细胞缺少足够的活化信号产生。在感染和肿瘤发生时，不同的环境条件可以刺激巨噬细胞分化为经典巨噬细胞(M1细胞)和替代巨噬细胞(M2细胞)[9-11]。在小鼠的包虫感染模型中，M1和M2在感染中均有不同程度的升高，宿主通过增强M1分泌白介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素12(IL-12)等炎症因子，产生复杂的炎症反应或诱导一系列免疫反应，积极清除入侵病原体；另一方面棘球蚴死亡或寄生时均会释放一些虫体抗原作用于宿主免疫系统，诱导出现M2为主的巨噬细胞极化，白介素10(IL-10)、转化生长因子-β(TGF-β)等因子水平升高，参与抗炎反应和组织修复的功能，不利于宿主对棘球蚴发挥免疫杀伤作用。因此维持机体内两型巨噬细胞免疫动态平衡在抗包虫感染中有重要意义，一旦M1和M2失衡，会使机体免疫功能紊乱，甚至丧失杀伤包虫的能力[12]。

1.2CD4+T细胞亚群及其因子在包虫感染中的作用机体感染棘球蚴后，通过APC提成抗原，诱导CD4+T/CD8+T细胞免疫，亦可刺激B细胞活化产生特异性的抗体体液免疫，最重要的是棘球蚴抗原影响CD4+T细胞免疫应答的调节作用。包虫感染不仅有辅助性T细胞(Th)相关Th1/Th2细胞失衡[13]，亦有辅助性T细胞和调节性T细胞(Treg)相关的Th17/Treg失衡，为避免包虫对人体的感染，感染早期机体产生以Th1为主导的细胞免疫和以Th17为主导的炎症反应，有利于抗包虫的免疫保护作用；感染晚期由于虫体持续生长，机体免疫反应偏向Th2介导的体液免疫，甚至出现Treg细胞负调控，免疫功能受抑制，不利于虫体的清除。研究发现随着Em感染的进展，促凋亡和抗凋亡机制也参与了T细胞亚群的改变，Bcl-2 mRNA等抗调亡相关基因表达下调，TNF-β、C-myc mRNA等促凋亡分子在局部的感染病灶中表达均上调，造成效应性CD4+T细胞凋亡，降低CD4+T/CD8+T细胞比值，不能对Em形成有效免疫应答[14]。

近年来，CD4+T细胞亚群的研究增多，滤泡辅助性T细胞(Tfh)是在外周器官淋巴滤泡中新发现的一群CD4+T细胞，其功能是促进B细胞成熟、产生抗体类型转变和淋巴滤泡生发中心的形成。CD4+T细胞激活后除了分化为Th1(T-bet)、Th2(GATA-3)、Treg(Foxp3)和Th17(ROR-γt)细胞，还可产生新的亚群Tfh细胞(Bcl-6)和Th9细胞(PU.1)。Tfh细胞升高与IgG抗体类型改变有关，在包虫患者中Tfh细胞数量和其细胞因子IL-21明显增加，循环型Tfh细胞表现为PD-1和CXCR5高表达，影响了患者IgG水平和IgG1/4亚类，参与棘球蚴感染的发生发展。Th9细胞是一群新的CD4+T细胞亚群，分泌IL-9发挥免疫调节作用，Pang等[15]首次发现包虫病患者Th9细胞、IL-9及其转录因子PU.1(spleen focus forming virus proviral integration oncogene，PU.1)表达均增加。TGF-β及IL-4联合刺激Th0分化产生Th9细胞，进而分泌IL-9，也存在TGF-β诱导效应性Th2/Tm(记忆T细胞)产生IL-9分化为Th9细胞。棘球蚴感染小鼠模型中发现Th9、转录因子PU.1和IL-9均升高，共同参与了免疫应答和调控，Th9细胞在感染晚期保持高水平，表明棘球蚴感染除了导致Th1/Th2和Th17/Treg细胞之间的失衡，Th9细胞可能在维持棘球蚴持续性感染中起重要作用。Pang等[16]深入研究发现包虫抗原激活Th0细胞中TGF-β/Smads通路促进了Th9分化，包虫病患者中TGF-β/Smads通路活化了转录因子PU.1表达，促进Th9分泌大量IL-9，参与肝细胞纤维化和病灶形成，有助于包虫病慢性化或进行性发展。IL-9表达水平上调，与包虫肉芽肿形成有关，有利于虫体逃避免疫清除功能在宿主体内寄生[17]。包虫感染导致的免疫逃避作用和Treg细胞相关联，促进外周免疫耐受功能的形成。包虫感染激活Th9细胞转录因子PU.1和IL-9时，能加剧体内Treg细胞的抑制功能，进而导致宿主发生Th17/Treg偏移，不利于免疫清除包虫[18]。庞楠楠[19-20]等和马秀敏等[21]前期研究发现在继发感染小鼠模型中，宿主感染早期以Th1型和Th17型细胞免疫为主，在晚期Th17细胞数量大幅减少，在CE患者Th17和IL-17中降低，说明可能是逐渐增多的Th9和IL-9促进棘球蚴感染的炎症反应。在包虫感染中Th9细胞和Tfh细胞等亚群变化特点的新发现，打破了长期认为Eg感染初期以Th1为主，晚期漂移为Th2型的固定模式[22]。在包虫病患者和模型中Tfh通过调控抗体类型改变、TGF-β/Smads通路活化Th9细胞及IL-9参与病灶形成，促进了包虫的寄生与发展，这些新发现为包虫免疫细胞研究开辟了新途径。

1.3免疫负性共刺激分子在包虫感染中的作用负性共刺激分子包括PD-1(programmed death 1)/PD-L1(B7-H1)/PD-L2(B7-DC)、CTLA-4(cytotoxic T lymphocyte antigen-4)/B7-1等，抑制或下调T细胞的活化和某些细胞因子的产生，在抗感染免疫中起负调节作用，增强机体对病原体的耐受，或降低机体对病原体的清除能力，或促进免疫抑制[23]。寄生虫与宿主之间需要通过一些协同刺激分子来维持机体的平衡，这些分子在平衡宿主的免疫调节中发挥着重要的作用，有利于Eg和Em在机体内的慢性感染和寄生。李艳华等[24]研究发现Em能在宿主体内长期寄生，可能与PD-1和CTLA-4等负性分子高表达，通过影响宿主Th1/Th2免疫应答平衡或免疫抑制CD8+T细胞攻虫作用及促效应性免疫细胞的凋亡等，发挥其免疫抑制性调节作用，使泡球蚴逃避宿主免疫细胞的致死性攻击。因此PD-1和CTLA-4在宿主的复杂免疫调节中有重要的意义，但是在Em感染过程中是如何进行调节来参加免疫作用的机制尚不明确。有可能在某些趋化性细胞因子的作用下，免疫细胞高表达PD-1与CTLA-4和分泌细胞因子作用于效应T细胞，抑制分泌IL-2和IFN-γ 等，阻碍效应细胞的增殖和功能，抑制了机体对入侵病原体的免疫清除作用，直接加剧了机体包虫的慢性感染[25]。近几年，免疫共刺激分子 (T cell immunoglobulin and mucin domain containing molecule-3, Tim-3)在肿瘤免疫和感染免疫研究中成为新的研究热点。Tim-3通过抑制活化信号的转导，发挥抑制性免疫调节作用，使机体无法产生对包虫的免疫应答作用，或Tim-3通过调节效应T细胞的凋亡，导致机体对包虫发生免疫耐受[26]。Galectin-9 (半乳糖凝集素9)作为Tim-3分子的配体，在包虫慢性感染的进展中有重要作用[27]。包虫感染免疫中Tim-3和配体Galectin-9结合形成通路可抑制Th1细胞增殖和产生相关细胞因子，或产生抑制信号诱导Th1细胞凋亡，干扰素-γ(IFN-γ)、IL-12下降，影响机体清除虫体的能力。本课题组赵慧等[28]发现可溶Tim-3(s Tim-3)在CE患者血清中明显升高，促进了Th1相关细胞因子IFN-γ和IL-12下降，IL-4显著升高，加重Th1/Th2细胞的失衡。Eg感染过程中负性分子Tim-3和Galectin-9表达的上调促进IL-4的分泌，抑制IL-2的产生，高表达Tim-3 的CD4+T细胞下调Th1和Th17等相关细胞因子的产生[29]。Tim-3/Galectin-9通路参与了包虫感染宿主的Th1型向Th2型转变，使Eg逃避机体的免疫清除作用，在肝脏内慢性寄生[30-31]。

2 包虫候选疫苗和抗原表位的特点

Eg和Em为逃避机体免疫系统的攻击，在寄生的宿主体内形成包囊性结构，包囊内的囊液有丰富的特异性抗原，正是该结构把包虫囊液与宿主免疫系统分隔开，就顺利的逃避了机体的免疫清除功能。疫苗预防接种是有效的抵制包虫感染的途径之一，但针对包虫病的天然保护性抗原极少能在机体中产生针对Eg和Em的抗感染免疫[32]。研究者们借助分子生物学的发展，筛选出一系列的包虫病疫苗候选分子。

2.1重组EG95疫苗EG95是提取细粒棘球蚴六钩蚴RNA后扩增出相应的cDNA，编码的相应基因片段，在细粒棘球蚴原头节、六钩蚴和成虫的生长周期中，EG95基因均有不同程度的表达[33]。在澳洲等畜牧业为主的地区，研究者们用EG95重组蛋白对羊进行免疫保护实验，研究结果证明EG95重组蛋白具有良好的免疫保护作用，不仅能有效的抑制Eg对机体的感染，还能抑制感染虫体的发育[34]，对绵羊的保护率可达96%～100%，一年后复测其抗体保护率也能达到86.3%[35-36]。经过生信学软件对Eg95抗原进行表位分析，研究结果为其包含6个优势T细胞表位和B细胞表位以及2个T-B联合优势表位[37]。提取AE患者中Em的mRNA并克隆扩增出Em95基因，经过生信学软件的分析，该抗原也存在T细胞表位和B细胞表位[38]。Lin等[39]用新疆种属的细粒棘球蚴作为模板筛选出新疆株的Eg95抗原，在新疆开展后续的免疫保护实验证实其具有良好的免疫保护性。

2.2EgM家族重组蛋白在世界范围内，中间宿主比终末宿主的数量要庞大数十倍，在新疆，羊与犬的比例也差距巨大，研究者们尝试用Eg感染犬后发现幼犬感染包虫时体内生长的成虫数量远高于曾感染过包虫的大龄犬，这一现象说明了犬的免疫系统在受到包虫的刺激后能抵抗再次感染。如果能控制终末宿主犬的感染，那么就能更好的控制包虫病的蔓延。Zhang等[40]发现了EgM家族重组蛋白能够有效的保护犬免受包虫的攻击。从Eg成虫和虫卵发育过程中分离出3种差异表达序列(egM4、egM9和egM123)，分别用这3种蛋白免疫犬，再用Eg原头节感染攻击犬，实验证明该抗原对犬有免疫保护作用，保护率高达97%～100%。

2.3EgA31蛋白疫苗EgA31基因是Fu[41]发现的由Eg编码在成虫体内高表达的类似副肌球蛋白的66kDa纤维蛋白。对EgA31蛋白疫苗在免疫后做的攻毒试验中发现重组EgA31蛋白在淋巴结节处有明显的细胞免疫反应，在动物实验模型中能诱导宿主产生强烈的体液免疫反应。EgA31蛋白可以与肌球蛋白相互作用，参与吸盘上肌纤维收缩，磷酸化后可参与虫体的免疫逃避[42]。李玉娇等[43]通过生信学软件对EgA31抗原进行表位分析，在该抗原上存在4个优势T细胞表位和5个B细胞表位及一个T-B联合表位[44]。在摩洛哥和突尼斯，有研究者们将EgA31和Eg Trp蛋白联合构成口服疫苗对犬进行免疫，研究证明该联合蛋白的免疫能够让犬抵抗Eg的感染。犬口服蛋白，隔21 d一次，共两次，第二次免疫20 d后以75 000个原头节对犬进行攻击感染，感染26～29 d后剖检犬，进行检测发现其荷虫量减少70%～80%，该蛋白的免疫有效的减缓了虫体发育的速度，说明犬的体内产生了抗Eg成虫的免疫保护效果[45]。

2.4Eg14-3-3蛋白Eg14-3-3序列因含有磷酸化的丝氨酸或苏氨酸残基，能够形成同源或异源复合物，在机体发生免疫反应时与特定的蛋白质进行结合，它作为高保守的蛋白家族调节机体蛋白的硫酸化作用。Eg14-3-3蛋白在机体参与免疫应答的包括信号转导、酶激活，细胞分裂和细胞凋亡等过程都能够发挥相应的免疫作用。用Eg14-3-3蛋白与QuliA佐剂结合免疫BALB/c鼠，进行免疫保护实验，免疫后再以2 000枚包虫虫卵攻击感染小鼠，经过后期的剖杀检测，感染小鼠荷虫量下降了97.35%[46]。

2.5EMY162和EgG1Y162抗原Kouguchi等[47]在研究中筛选针对Em疫苗候选蛋白时发现了EMY162抗原，该蛋白是分泌型蛋白质，具有膜表面锚定抗原的作用，与早期寄生虫进入机体诱导一系列免疫反应有关。Li等[46]通过表位分析发现该蛋白通常有跨膜区域，说明蛋白的折叠性和柔韧性较好，成为疫苗候选蛋白的可能性很高。跨膜区域的存在和跨膜蛋白质的存在也保证了微生物和寄生虫感染机体后通过细胞膜进行免疫应答的调节。本课题组曹春宝等[48]在研究细粒棘球蚴(Eg)中发现了新基因egG1Y162抗原基因，该抗原基因已送登基因库(Genebank)。蛋白免疫印迹检测结果显示，egG1Y162重组抗原能够与感染犬血清发生反应，说明该抗原在机体免疫反应中存在高度的敏感性和特异性反应。通过生信学软件分析，egG1Y162抗原有6个T细胞和B细胞抗原优势表位，这些表位在抗棘球蚴感染的保护性作用中起着至关重要的作用。本课题组对egG1Y162基因进行分子克隆，蛋白的诱导和表达，在动物保护实验结果中，重组蛋白疫苗能够激活小鼠对包虫感染的免疫保护作用，结构中存在能有效地刺激特异性抗体的抗原表位。在后期的实验中MA[49]对该基因进行深入的分析后，用电穿孔法构建的BCG-egG1Y162联合疫苗免疫小鼠，进一步证明egG1Y162对宿主有免疫保护作用，在疫苗研究中可以作为包虫病疫苗良好的候选分子[50]。

包虫病的感染是一个复杂的免疫过程，机体免疫的平衡对预防包虫的感染有重要的意义，只有及时的纠正细胞之间的失衡才能有效的避免寄生虫免疫逃避。免疫预防也是控制包虫病传播的重要措施之一，针对后期包虫疫苗的研制，本文涉及了多个候选疫苗分子，在逐一的介绍过程中，更清晰的了解了它们的特性和表位信息。这些疫苗候选分子都与棘球蚴病的发生与发展密切相关，对其深入研究将会为针对性地开发抗棘球蚴疫苗提供重要的实验依据。