毛蕊异黄酮介导IκB/NF-κB信号通路对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用*

姚瀚勋，李晓斌，邱 晟，王 勇，王文波

(1.浙江省湖州市中心医院/浙江大学湖州医院神经外科 313000；2.桂林医学院生理学教研室，广西桂林 541001；3.桂林医学院附属医院神经外科，广西桂林 541001)

毛蕊异黄酮是来源于黄芪的一种天然黄酮类化合物，具有抗炎、类雌激素等作用[1-2]。既往研究已经发现毛蕊异黄酮具有体外抗氧化的作用[3]。本研究通过建立局灶性脑缺性再灌注的大鼠模型，探讨毛蕊异黄酮的体内抗氧化作用及神经保护的分子机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1动物与试剂 3月龄SD雌性大鼠100只，SPF级，体质量225～275 g，由桂林医学院实验动物中心提供，合格证号:SCXK(桂)2013-0006。毛蕊异黄酮，溶剂为0.1 mol/L 二甲基亚砜(dimethyl sulphoxide，DMSO，生产批号：20140720)，由天津马克生物技术有限公司提供。总蛋白(TP)测定试剂盒(生产批号:20140118)、丙二醛(MDA)测定试剂盒(生产批号：20140117)、超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒(生产批号：20140109)由南京建成生物工程研究所提供。TRIzol 试剂，cDNA 第一链合成试剂盒由美国Thermo Fisher公司提供。Real time PCR Master Mix由日本Toyobo公司提供。反转录试剂盒、提取试剂盒、引物由上海生工生物工程技术服务有限公司提供。兔源磷酸化核转录因子-κB(NF-κB)p65单抗、辣根过氧化物酶(HRP)标记兔抗鼠IgG和GAPDH抗体由Santa Cruz提供。4%多聚甲醛、DAB显色试剂盒、蛋白上样缓冲液、BCA蛋白定量试剂盒、硝酸纤维素(NC)膜、氯化三苯四氮唑(triphenyltetrazolium chloride，TTC)10 g/瓶(生产批号：080414)由武汉博士德生物工程有限公司提供。

1.2方法

1.2.1分组并建立模型 大鼠分成5组，每组20只：缺血再灌注组(模型组)，毛蕊异黄酮高(20 mg/kg)、中(10 mg/kg)、低(5 mg/kg)剂量组，假手术组。灌胃给药，每天上、下午各1次，连续给药14 d。模型组和假手术组灌等量DMSO。末次给药1 h后，除假手术组不制备栓塞外，其余各组采用大脑中动脉线栓法(middle cerebral artery occlusion，MCAO)制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型。若大鼠清醒后出现以下4种表现时，(1)左侧Horner征阳性；(2)右侧前肢瘫痪；(3)提起鼠尾后不能伸右前肢；(4)右旋时右前肢拖在腹下，与左前肢交叉成剪刀状，则表明模型制作成功。

1.2.2神经行为学检查 于给药前及处死前进行Bederson′s评分：行为都正常记0分；提鼠尾离地约1尺，手术对侧前肢内旋、内收记1分；推大鼠双肩，手术对侧抗力下降记2分；观察大鼠在水平面行走情况，围绕健侧转圈记3分；不能自主活动记4分。分数越高说明神经损伤越严重。

1.2.3脑梗死体积测定 脑缺血2 h后拔除线栓，恢复再灌注24 h后断头取脑，从视交叉起作2 mm层厚冠状切片，将脑片放入2% TTC磷酸盐缓冲液中37 ℃恒温避光孵育30 min，正常脑组织呈现红色，梗死脑组织呈现白色。脑片排列整齐并拍照，使用图像分析软件处理，计算每张脑片的梗死面积，乘以厚度2 mm再相加即为脑梗死体积。

1.2.4脑组织含水量测定 采用干湿法，脑组织含水量(%)=(脑组织湿质量-脑组织干质量)/脑组织湿质量×100%。

1.2.5脑组织中SOD、MDA测定 采用考马斯亮蓝法测定各组蛋白水平，采用TBA法测定MDA，采用比色法测定SOD，所有操作均按照试剂盒说明书进行。

1.2.6脑组织中IκB、NF-κB mRNA的表达水平测定 用TRIzol法提取总RNA，紫外分光光度仪测定提取的总RNA浓度。PCR反应条件为95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s 共40个循环，取PCR产物4 μL进行琼脂糖凝胶电泳，采用凝胶成像系统和图像分析系统进行成像及灰度分析，以GAPDH 为参照，分别计算IκB/GAPDH、NF-κB/GAPDH mRNA的比值。

1.2.7脑组织中IκB α、NF-κB p65蛋白表达水平测定 脑组织按1∶5加入蛋白裂解液，超声粉碎，4 ℃裂解过夜，4 ℃ 12 000 r/min低温离心30 min，取上清液，BCA比色法测定蛋白水平，上样(50 μg/孔)后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，将蛋白质提取物分离，再转至NC膜，牛血清清蛋白(BSA) TBST缓冲系统37 ℃封闭1 h，磷酸化NF-κB p65单克隆抗体孵育2 h，HRP标记兔抗鼠IgG抗体37 ℃孵育1 h，DAB显色，RAD凝胶电泳图像分析仪进行采图，Quanlity One软件分析光密度值。

2 结 果

2.1毛蕊异黄酮对大鼠神经行为学评分、脑梗死体积、脑组织含水量的影响 模型组有明显的神经行为学损伤(P<0.05)，毛蕊异黄酮可改善其神经行为学评分，以毛蕊异黄酮高剂量组最为显著(P<0.05)；模型组有明显的脑梗死发生(P<0.05)，毛蕊异黄酮可降低其脑梗死体积，以毛蕊异黄酮高剂量组最为显著(P<0.05)；模型组梗死侧脑组织含水量明显高于假手术组(P<0.05)，毛蕊异黄酮可降低其脑组织含水量，以毛蕊异黄酮高剂量组最为显著(P<0.05)，见表1。

表1 各组大鼠神经行为学评分、脑梗死体积、脑组织含水量比较

a：P<0.05，与假手术组比较；b：P<0.05，与模型组比较

2.2毛蕊异黄酮对大鼠脑组织中SOD活性及MDA水平的影响 缺血再灌注24 h后，模型组MDA水平明显升高(P<0.05)，SOD活性明显减弱(P<0.05)，毛蕊异黄酮能明显降低脑组织中MDA的水平并提高SOD活性，以毛蕊异黄酮高剂量组最为显著(P<0.05)，见表2。

表2 各组大鼠脑组织中SOD活性及MDA水平比较

a：P<0.05，与假手术组比较；b：P<0.05，与模型组比较

2.3毛蕊异黄酮干预后大鼠脑组织中IκB、NF-κB mRNA的表达情况 模型组大鼠脑组织中IκB mRNA水平明显减少(P<0.05)，而NF-κB mRNA水平显著增加(P<0.05)。毛蕊异黄酮干预后，IκB mRNA水平明显升高，而NF-κB mRNA水平则明显降低(P<0.05)，见表3。

表3 各组大鼠脑组织中IκB、NF-κB mRNA的表达情况比较

a：P<0.05，与假手术组比较；b：P<0.05，与模型组比较

2.4毛蕊异黄酮干预后大鼠脑组织中IκB α、NF-κB p65蛋白的表达情况 模型组大鼠脑组织中IκB α蛋白水平明显减少(P<0.05)，而NF-κB p65蛋白水平显著增加(P<0.05)。毛蕊异黄酮干预后，IκB α蛋白水平明显升高，以毛蕊异黄酮高剂量组最为显著(P<0.05)，而NF-κB p65蛋白水平则明显降低(P<0.05)，见表4、图1。

表4 各组大鼠脑组织中IκB α、NF-κB p65蛋白的表达情况比较

a：P<0.05，与假手术组比较；b：P<0.05，与模型组比较

图1 各组大鼠脑组织中IκB α、NF-κB p65蛋白表达的电泳图

3 讨 论

急性缺血性脑卒中是最常见的卒中类型，脑血流的中断导致能量的衰竭和神经元的死亡，可触发免疫应答、外周白细胞浸润脑实质和小胶质细胞的激活。当缺血脑组织获得再灌注后，产生大量的活性氧(ROS)自由基，能刺激白细胞活化并释放多种炎性细胞因子[肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)]、基质金属蛋白酶(MMP)、一氧化氮(NO)和更多的ROS，攻击血管壁，破坏血脑屏障(BBB)，引起继发性脑损伤[4-7]。本实验中，模型组大鼠存在严重的神经行为学损伤，脑梗死和脑水肿均较假手术组严重。

毛蕊异黄酮是从中药黄芪中提取出来的生物黄酮，研究表明其在缺血性脑损伤中具有神经保护作用[8-10]，且分子量小，较易通过血脑屏障，将其用于治疗脑血管疾病存在天然优势。SOD是脑组织中清除自由基的有效成分，而MDA可以反映氧自由基的生成量并间接反映细胞损伤的程度。本实验中，毛蕊异黄酮能增强脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织中SOD活力，降低MDA 的水平，从而有效地减轻氧自由基的破坏作用，保护脑细胞。

NF-κB是一种广泛存在于真核细胞内的转录因子，主要由p65和p50组成，是炎性反应复杂细胞因子网络的关键环节[11]。IκB α是NF-κB的抑制蛋白，静息状态下，能够以三聚体的形式将NF-κB限制在细胞质中。在受到外源性刺激(如脑缺血再灌注损伤)时，IκB α降解，失去抑制作用的NF-κB具有了活性，进入细胞核与DNA结合，作用于结构基因的调控序列，促进大量炎性因子的转录；若使用抗氧化剂则可以抑制NF-κB信号通路的激活从而减轻脑组织的缺血再灌注损伤[12-17]，而增加IκB α的表达恰恰可以抑制NF-κB p65的表达[16]。本实验中，模型组IκB α的表达水平明显降低，NF-κB p65的表达水平明显升高，表明脑缺血再灌注后由于炎性反应被激活，IκB α的抑制作用解除，NF-κB 水平迅速升高。而毛蕊异黄酮的干预可明显提高缺血再灌注后脑缺血组织中IκB α的表达，且IκB α表达水平的增加可抑制NF-κB的进一步表达，表明毛蕊异黄酮可以通过恢复IκB α的活性来抑制由缺血再灌注引起的NF-κB信号通路激活，从而减轻炎性反应，保护脑组织。

综上所述，毛蕊异黄酮对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤有保护作用，其机制可能与抑制IκB α/NF-κB信号通路的激活有关，提示毛蕊异黄酮在预防和减轻脑缺血再灌注损伤方面具有潜在的应用前景。