探讨线栓法建立大鼠局灶性脑缺血模型的影响因素

袁洪霞 石国凤 闫 冰 张真容 刘小亮

贵阳中医学院，贵州省贵阳市 550002

脑血管病的发病率呈逐年上升趋势，其中缺血性脑血管病占80%以上，给患者及家庭乃至整个社会造成巨大的负担[1]。因此，对于研究缺血性脑卒中病理机制及治疗评价的研究具有重要价值，线栓法制作局灶性脑缺血模型(MCAO)是目前较为公认且比较经典的模型[2]，而且线栓法制备MCAO具有无需开颅、创伤小、不需要特殊设备、缺血区部位较恒定等特点[3]，但线栓法仍存在手术操作复杂、死亡率高等问题[4]。本文探讨造模环境温度控制、线栓插入部位以及术后2h内大鼠苏醒活跃状态对造模的影响，以此来减少手术复杂性，提高模型的稳定性和造模的成功率。

1 材料和方法

1.1 实验动物 由第三军医大学实验动物中心[SCXK：2012001]提供清洁级雄性SD大鼠60只，体重为150～200g，于贵阳中医学院中心实验室饲养2周，自由饮食，术前禁食12h，不禁水，待大鼠体重达200～300g开始于贵阳中医学院中心实验室实施造模。分组：将60只大鼠随机抽分成四组，即对照组1(15只)，对照组2(15只)，对照组3(15只)，实验组(15只)。所有动物实验均取得贵阳中医学院动物实验伦理委员会批准。

1.2 方法 对照组1在夏季自然未控制外环境温度(30℃以上)下实施手术，线栓从颈总动脉插入，并且术后2h内大鼠均处于麻醉未清醒状态；对照组2的大鼠线栓从颈外动脉插入，外环境温度控制在(25±1)℃，并且术后2h内大鼠均处于麻醉未清醒状态；对照组3的大鼠术后2h内大鼠均处于麻醉清醒活跃状态，线栓从颈总动脉插入，外环境温度控制在(25±1)℃；实验组大鼠线栓从颈总动脉插入，外环境温度控制在(25±1)℃并且术后2h内大鼠均处于麻醉未清醒状态。

1.3 线栓的制作 先将直径为0.26mm的尼龙鱼线(德国进口原丝，拉力、抗节力≥日本原丝130%)从断面平剪切成长度为5.0cm的线栓，然后将剪好的线栓一端距离火焰约1cm处旋转线栓并将其头端烧制成光滑球形并蘸融化的液体石蜡，垂直待干，显微镜下筛选表面光滑均匀、头端的直径约(0.34±2)mm的栓线，用黑色标记笔分别在头端、距头端18mm处、距头端20mm处和25mm处作标记待干，然后放置在75%酒精清洁后浸泡于无菌生理盐水中备用。

1.4 模型制作 用浓度为7%的水合氯醛按0.5ml/100g量从腹腔注射麻醉大鼠，仰卧于固定台上，头朝向手术者，颈部正中备皮约3cm×3cm，用酒精消毒，沿颈部正中纵行切开1.5～2.0cm的切口，用玻璃分针钝性分离周围结缔组织和肌肉，用自制消毒处理后的弯钩撑开两侧肌肉组织暴露手术视野，游离右侧颈总动脉(CCA)和颈内动脉(ICA)即可，然后在颈总动脉上分别结扎缝线，在距分叉约5mm处结扎松、3mm处结扎紧，在松紧结之间做V型切口，然后从切口处插入已备好的线栓，有头端的先进入，将线栓插入到分叉处时垂直提取颈总动脉残端并与颈内动脉入口成同一直线并顺利进入颈内动脉[该法不易误入翼腭动脉(PPA)]，继续向内进线栓，当线栓插入从分叉处估量约10mm有阻碍时，不能盲目再向前用力插及盲目的反复退、进，这些都易导致线栓插破大脑中动脉，造成蛛网膜下腔出血，正确的顺利插入的方法是先将线栓退大约5mm，然后将线栓向外转20°～30°的方向，并将线栓由垂直转换成与操作台平行略下，再向前插入直至再次有阻碍从分叉处算起，插入线栓长度为18～22mm，然后将线栓留置2h后拔出线栓并缝合。

1.5 判断其模型成功的标志 Zea-Longa评分：待手术24h后采用Zea-Longa的5级4分法对模型进行神经功能缺损评分[5]:0 分为无神经功能缺失症状，活动正常；1分为不能完全伸展对侧前肢；2分为行走时身体向偏瘫侧转圈；3分为行走时向偏瘫侧倾倒；4分为不能自发行走，意识丧失。将评分1～3分大鼠为MCAO模型。眼球颜色[6]：右侧缺血侧眼球小且发暗灰白有时伴有一定的分泌物, 左侧与健康大鼠的眼球基本一致。TTC染色：将完整的大脑取出放于-20℃冰箱20min后取出在冰盒上将整个脑冠状切成约2mm厚的薄片5片，将5片薄片放入浓度为1%TTC染液中(PBS配制，注意避光)，37℃染30min。观察脑梗死大鼠梗死部分呈苍白色，健康大鼠及假手术大鼠为均匀红色，无梗死灶。

2 结果

对照组1在高温环境下手术死亡数量与实验组比较,差异无统计学意义(P=0.107>0.05)；对照组2线栓从颈外动脉插入死亡数量与实验组比较,差异均具有统计学意义(P=0.025<0.05)；对照组3术中、术后2h内老鼠处于苏醒活跃状态死亡数量与实验组比较，差异均具有统计学意义(P=0.021<0.05)。见表1。

表1 四组大鼠死亡数(只)及死亡率

3 讨论

虽然本研究通过统计发现在非控制外环境温度(30℃以上)与温度控制在(25±1)℃进行造模差异并无统计学意义，但从数据上看，在夏季温度高的环境下造模死亡数还是较高，本研究的该数据统计结果无意义，可能是因为本组的大鼠数量不够。但是，仍然有研究报道指出高温环境下会造成机体免疫功能、呼吸系统、水电解质平衡、神经内分泌、血流动力学、能量代谢等系统和器官功能改变[7]，因此严格将术中室内温度控制在适宜范围内能减少大鼠术中、术后的损害。但高温环境下对造模成功率的影响还需要进一步研究确定。

进线栓部位常见有三处，颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)及颈内动脉(ICA)，多数研究者主要从颈总动脉[8]、颈外动脉[9]进线栓经颈内动脉到大脑中动脉并阻断该处血流，少部分研究者从颈内动脉入线栓[10]。根据本实验研究结果和过程进行分析，从颈总动脉、颈外动脉入线栓各自的优缺点:从颈总动脉入线栓，直接分离出颈总动脉及颈内动脉即可，具有易操作、创伤性小、操作时间快、进线栓快、进线栓顺利、缺血模型持久以及存活率高等优点，缺点就是结扎一侧颈总动脉后再灌注的实现需要另一侧颈总动脉供血；从颈外动脉入线栓，需要分离颈总动脉、分叉处、颈外动脉及颈内动脉，从该处入线栓操作时间长、创伤性大、线栓不易顺利插入到大脑中动脉并易插入到翼腭动脉,并且会因手术过程中的过度牵拉和手术时间延长易致大鼠死亡，但从颈外动脉插入是结扎的颈外动脉，不结扎颈总动脉，恢复再灌注仍然由该侧的颈总动脉供血实现。

拔线栓时和缝合到未苏醒这一过程中的细节不容忽视，这些问题在很大程度上影响大鼠术后的存活率。拔线栓时禁忌老鼠处于苏醒状态，在手术过程中和留置线栓过程中一定要随时观察大鼠的角膜反射并多次少量补麻醉药，研究过程中采取每隔30min根据角膜反射相应的补充首次麻药量的1/5～1/4，目的是为了拔线栓和缝合时老鼠处于麻醉未苏醒状态，首先有利于手术的顺利操作，其次能降低术后死亡率。大鼠苏醒状态时实施拔线栓及缝合，大鼠应激和疼痛反应较大，就会做出本能的过强的应激性反应，比如翻身逃跑等，也就是大鼠刚在缺血再灌注过程进行了被动及主动活动行为，排除其他死亡原因24h内大鼠死亡率较高，因此在进行缺血再灌注未苏醒前，仍然要注意不能进行过多的搬动老鼠及出现大鼠主动活动。

线栓法是大量研究者常用的建立大鼠局灶性脑缺血模型方法[11]，该模型被普遍认为是脑缺血标准动物模型[12]，但会因为在术中术后各种因素的影响而影响造模的成功率，本研究主要从环境温度高低、入线栓部位以及拔线栓时的注意问题和2h内大鼠是否处于麻醉未清醒状态对造模的影响进行分析，选择最佳的造模条件和环境，提高造模的成功率，减少手术时间和创伤程度。影响该手术因素还有很多，如麻醉药的选择和线栓材质的选择方面，需要在实验过程中注意控制好每一个影响成功率导致失败的因素，只有不断的进行实践研究与改进，才能使该精细手术的影响因素降到最低，从而制备出标准的、存活率高、稳定性好、重复性好、成功率高的理想大鼠局灶性脑缺血再灌注模型。