E3泛素连接酶c-CBL对血管紧张素Ⅱ诱导后小鼠原代心肌成纤维细胞表型转换影响

刘美丽， 刘 丹， 成小丽， 邢瑞楠， 田孝祥, 闫承慧

北部战区总医院 心血管内科，辽宁 沈阳 110016

心肌纤维化是指心肌组织中细胞过度增殖以及细胞外基质过度堆积的一种疾病[1-3]。心肌纤维化发生过程中，心肌成纤维细胞发生表型转换，活化为心肌肌成纤维细胞。而这类细胞可过度增殖和大量分泌细胞外基质，包括胶原和基质金属蛋白酶等，这些物质在心肌中大量沉积造成心肌结构改变，最终导致心室重构[4-8]。E3泛素连接酶c-CBL(casitas B-lineage lymphoma)为酪氨酸激酶信号转导的负性调控因子[9-14]。c-CBL在各个组织和细胞中广泛表达，其中，在心脏及免疫细胞中的表达量较高。有研究表明，c-CBL在心血管、炎症反应及肿瘤的发生发展中具有重要的生物学作用[15-18]。然而，c-CBL对心肌成纤维细胞表型转换的影响尚不清楚。因此，本研究采用血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ)刺激小鼠原代心肌成纤维细胞，构建心肌成纤维表型转换模型，通过建立c-CBL低表达细胞，再给予Ang Ⅱ刺激，检测c-CBL对小鼠原代心肌成纤维细胞α-平滑肌肌动蛋白(α smooth muscle actin，αSMA)和胶原1(collagen 1)分泌的影响，旨在细胞水平明确c-CBL经Ang Ⅱ刺激后，对小鼠心肌成纤维细胞表型转换的影响。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 小鼠c-CBL基因的小干扰RNA(中国生工生物公司)，RNAi MAX转染试剂(美国Thermo公司)，RNA提取试剂盒(美国Promega公司)，反转录试剂盒(日本TakaRa公司)，蛋白裂解液(美国Thermo公司)，抗c-CBL抗体(美国Santa公司)，αSMA抗体(美国Sigma公司)，collagen 1抗体(美国abcam公司)。

1.2 研究方法

1.2.1 小鼠原代心肌成纤维细胞分离及培养 采用0.2%Ⅱ型胶原酶提取C57乳鼠原代心肌成纤维细胞。将C57乳鼠置于75%乙醇中消毒，在超净台中将C57乳鼠心脏分离后，PBS清洗4次后，将心脏剪成细小的组织块。采用0.2%Ⅱ型胶原酶消化心脏组织块，37℃消化1 h，用含抗生素和10%胎牛血清的DMEM培养基中和消化的组织块，1 000 r/min离心5 min。用DMEM培养基悬浮细胞沉淀，贴壁2 h后，更换培养基。48 h后显微镜下观察细胞生长状态。

1.2.2 Ang Ⅱ刺激 将小鼠原代心肌成纤维细胞分为对照组(未刺激)与Ang Ⅱ刺激组。Ang Ⅱ刺激组为不同浓度(1 μM和10 μM)的Ang Ⅱ刺激24 h。当小鼠原代心肌成纤维细胞融合至70%～80%时，给予不同浓度的Ang Ⅱ(1 μM和10 μM)刺激细胞24 h后，收集细胞提取RNA和蛋白。

1.2.3 构建低表达c-CBL细胞及Ang Ⅱ刺激 当细胞融合至80%时，使用opti-MEM培养基和RNAi MAX转染试剂将c-CBL的小干扰RNA(si-CBL)转染至细胞中，对应的小干扰RNA对照(si-control)转染至细胞中，转染后6 h，换为含10%胎牛血清的DMEM培养基。转染24 h收集细胞备用。待确定转染条件后，将细胞分为si-control组(小干扰RNA对照转染细胞24 h)、si-CBL组(c-CBL小干扰RNA转染细胞24 h)、si-control+Ang Ⅱ组(小干扰RNA对照转染24 h后给予Ang Ⅱ刺激24 h)、si-CBL+ Ang Ⅱ组(c-CBL小干扰RNA转染24 h后给予Ang Ⅱ刺激24 h)，提取RNA和蛋白。

1.2.4 RNA提取及荧光定量聚合酶链式反应 使用RNA提取试剂盒提取细胞总RNA。采用反转录试剂盒对细胞总RNA(500 ng)进行反转录反应，以获取细胞cDNA。采用SYBR Green法对cDNA行荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)来扩增c-CBL基因、αSMA基因和collagen 1基因。

1.2.5 蛋白提取及Western blot检测蛋白表达 根据细胞总量，加入适量的蛋白裂解液，冰上裂解30 min。4℃，13 000 r/min离心15 min，上清为细胞总蛋白。BCA法对蛋白进行定量。应用SDS-PAGE胶对40 μg细胞总蛋白进行电泳。一抗采用抗c-CBL抗体和αSMA抗体；二抗使用HRP标记的抗体。采用Image-Pro Plus 6.0软件进行灰度分析。

1.2.6 免疫荧光染色 将细胞加到含有细胞玻片的6孔板中，待细胞融合至80%时，进行si-CBL及si-control转染，于转染后24 h再给予Ang Ⅱ刺激24 h。将细胞玻片取出，PBS洗3次，4%多聚甲醛固定10 min，PBS洗3次。应用Triton X-100(0.5%)通透10 min，PBS洗3次。山羊血清封闭30 min，加入collagen 1的抗体，4℃孵育过夜。次日使用带荧光标记的二抗(1∶100)进行室温避光孵育2 h，DAPI染细胞核。荧光显微镜下观察染色结果。

2 结果

2.1 不同Ang Ⅱ刺激条件对小鼠原代心肌成纤维细胞αSMA及c-CBL表达的影响 Ang Ⅱ刺激组αSMA基因mRNA和蛋白均明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。但αSMA在1 μM与10 μM浓度Ang Ⅱ刺激下的表达比较，差异无统计学意义(P>0.05)，提示小鼠原代心肌成纤维细胞表型转换模型建立成功。Ang Ⅱ刺激组c-CBL基因mRNA和蛋白水平均明显高于对照组(P<0.05);但c-CBL在1 μM与10 μM浓度Ang Ⅱ刺激下的表达比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。

图1 不同Ang Ⅱ刺激条件下小鼠原代心肌成纤维细胞αSMA和c-CBL的表达(a.荧光定量PCR检测不同浓度Ang Ⅱ刺激细胞后αSMA和c-CBL基因mRNA表达；b～c. Western blot检测不同浓度Ang Ⅱ刺激细胞后αSMA和c-CBL蛋白表达)

2.2 建立低表达c-CBL的小鼠原代心肌成纤维细胞模型 荧光定量PCR结果发现， si-CBL组c-CBL基因mRNA表达显著低于si-control组，是si-control组的0.35倍，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2a。这提示在基因水平si-CBL干扰效果较好。Western blot结果显示，si-CBL组c-CBL蛋白较si-control组显著降低，是 si-control组的0.32倍，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2b～2c。上述结果提示，转染小干扰RNA可成功建立低表达c-CBL的小鼠原代心肌成纤维细胞模型。

图2 建立低表达c-CBL的小鼠原代心肌成纤维细胞模型(a.荧光定量PCR检测si-CBL转染细胞后c-CBL基因mRNA表达；b～c.Western blot检测si-CBL转染细胞后c-CBL蛋白表达)

2.3 c-CBL对Ang Ⅱ刺激后小鼠原代心肌成纤维细胞αSMA表达的影响 si-control组和si-CBL组αSMA基因mRNA和蛋白水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。Ang Ⅱ刺激后，si-control+Ang Ⅱ组和si-CBL+Ang Ⅱ组αSMA基因mRNA和蛋白较si-control组和si-CBL组明显增加，且si-CBL+Ang Ⅱ组αSMA基因mRNA和蛋白的表达均明显低于si-control+Ang Ⅱ组，差异均有统计学意义(P<0.05)。上述结果提示，低表达c-CBL能降低Ang Ⅱ刺激后αSMA表达。见图3。

图3 c-CBL对Ang Ⅱ刺激后小鼠原代心肌成纤维细胞αSMA表达的影响(a.荧光定量PCR检测各组aSMA基因mRNA表达；b～c.Western blot检测各组aSMA蛋白表达)

2.4 c-CBL对Ang Ⅱ刺激后小鼠原代心肌成纤维细胞collagen 1表达的影响 si-control组和si-CBL组collagen 1基因mRNA比较，差异无统计学意义(P>0.05)。而Ang Ⅱ刺激后，si-control+Ang Ⅱ组和si-CBL+Ang Ⅱ组collagen 1基因mRNA均较si-control组和si-CBL组明显增加，且si-CBL+Ang Ⅱ组collagen 1基因mRNA水平明显低于si-control+Ang Ⅱ组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图4。

图4 c-CBL对Ang Ⅱ刺激后小鼠原代心肌成纤维细胞collagen 1表达的影响(a.荧光定量PCR检测各组collagen 1基因mRNA表达；b.免疫荧光检测各组collagen 1表达，绿色荧光为collagen 1表达，蓝色荧光为细胞核)

3 讨论

心肌成纤维细胞表型转换在心肌纤维化过程中发挥重要作用。在一些病理因素作用下(Ang Ⅱ和缺氧等)，心肌成纤维细胞被激活转换成心肌肌成纤维细胞，这类细胞通过增殖和分泌细胞外基质成分，进而参与心肌的损伤与修复。心肌成纤维细胞过度增殖，过度分泌的胶原等物质在心肌大量堆积，可造成心肌的不可逆损伤[19-20]。c-CBL在扩张型心肌病患者心肌组织中的表达增加。c-CBL基因敲除的小鼠在心肌缺血再灌注损伤后心功能明显改善，且其下游关键的调控因子EGFR和FAK基因在c-CBL敲除的小鼠中明显下调。在心肌细胞中，通过抑制c-CBL或抑制c-CBL泛素化配体的活性可减轻H2O2对心肌细胞的损伤[18]。

本研究结果发现，Ang Ⅱ刺激后，心肌成纤维细胞中αSMA基因mRNA和蛋白水平明显增加，提示Ang Ⅱ可诱导心肌成纤维细胞发生表型转换。在小鼠心肌成纤维细胞发生表型转换的过程中，c-CBL基因mRNA和蛋白表达均明显增加，提示c-CBL在小鼠心肌成纤维细胞表型转换中可能发挥重要作用。在c-CBL低表达细胞模型中给予Ang Ⅱ刺激，以明确c-CBL对心肌成纤维细胞表型转换的影响。结果发现，与si-control组相比较，si-CBL组细胞在未给予Ang Ⅱ刺激时，αSMA和collagen 1基因mRNA和蛋白均无明显改变，说明在正常生理情况下，c-CBL对心肌成纤维表型转换不产生影响。因此，在si-CBL细胞中给予Ang Ⅱ刺激后再检测心肌成纤维细胞αSMA和collagen 1的表达。结果发现，c-CBL低表达后可降低Ang Ⅱ刺激后αSMA和collagen 1的表达，提示c-CBL对Ang Ⅱ诱导的心肌成纤维细胞表型转换具有重要的调控作用。本研究也存在一定的局限性。首先，虽然已证实c-CBL对Ang Ⅱ诱导的小鼠原代心肌成纤维细胞表型转换具有重要的调控作用，但具体的机制尚不清楚。有研究表明，c-CBL通过泛素化相应的配体发挥生物学作用，如c-CBL通过介导β-连环蛋白的降解参与结肠癌细胞的生长和血管新生[21]。但c-CBL能否通过介导相应的泛素化配体参与心肌成纤维细胞表型转换的调控还尚未清楚。miRNA是一类非编码RNA分子，通过调控下游靶基因参与多种生物学效应。有研究表明，miR124-3p可通过调控c-CBL参与乳腺癌细胞的生长、增殖和浸润[22]。那么，c-CBL是否也受到miR124-3p或其他miRNAs的调控参与心肌成纤维细胞表型的转换尚不明确。今后，需要从miRNA和泛素化角度探讨c-CBL对小鼠原代心肌成纤维细胞表型转换的调控机制。

综上所述，Ang Ⅱ刺激后心肌成纤维细胞c-CBL表达明显增加，低表达c-CBL可抑制Ang Ⅱ诱导的心肌成纤维细胞表型转换。