结肠直肠癌与胆汁酸代谢、肠道菌群分布水平的相关性研究

郭 磊, 朱海杭, 周步良

(1. 扬州大学, 江苏 扬州, 225000; 2. 南京鼓楼医院集团仪征医院, 江苏 扬州, 225000;3. 江苏省苏北人民医院, 江苏 扬州, 225000)

研究[1]显示，在结肠直肠癌的发生过程中，胆汁酸可能通过不同的途径诱导结肠直肠癌细胞的增殖，而高浓度的次级胆汁酸则对肿瘤有促进作用。肠道菌群数量变化在结肠直肠癌的发生、发展中可能发挥一定的作用，如结肠直肠癌患者大肠埃希菌、屎肠球菌和酵母菌数量明显增加，双歧杆菌和乳酸杆菌数量明显减少。目前，肠道菌群参与结肠直肠癌的发生、发展机制尚不明确，而有关胆汁酸、次胆汁酸代谢、肠道菌群以及G蛋白偶联胆汁酸受体5(TGR5)在结肠直肠癌中表达的研究也不多见[2]。本研究通过检测结肠直肠癌患者的胆汁酸水平、肠道菌群的分布，探讨胆汁酸代谢、次级胆汁酸代谢与肠道菌群在结肠直肠癌发病中的相关性，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2017年3月—2018年3月本院胃肠外科行手术治疗的结肠直肠癌患者80例为结肠直肠癌组，男52例，女28例，平均年龄(56.40±16.50)岁。另选取正常体检人群80例作为对照组，男50例，女30例，平均年龄(53.40±7.67)岁。2组患者抽取的血浆标本均为乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝外周血血浆。收集结肠直肠癌根治术后的癌组织(经病理证实)和癌旁组织(肉眼观察距癌组织2 cm)处的粪便。所有患者术前无放疗、化疗史，标本提取后投入液氮中冷冻，存放在-80℃的低温冰箱中保存。结肠直肠癌患者性别、年龄、病理分型、肿瘤细胞分化程度、肿瘤细胞浸润程度、淋巴结转移和周围淋巴血管侵犯等临床病理资料完整。参照2010年第7版国际抗癌联盟(UICC)/美国癌症肿瘤联合会(AJCC)的结肠直肠癌临床病理诊断标准，包括Ⅰa期结肠直肠癌6例, Ⅰb期14例, Ⅱa期24例, Ⅱb期14例, Ⅲa期18例, Ⅲb期4例。根据TNM病理诊断标准分为高分化4例，中分化60例，低分化16例。有8例结肠直肠癌患者发生远处转移。

1.2 研究方法

抽取结肠直肠癌组患者和正常体检人群的血液，利用生化仪酶促法检验总胆汁酸及次级胆汁酸表达水平，并将其与正常体检人群的血液总胆汁酸及次级胆汁酸表达水平进行对比。收集癌组织黏膜、正常组织黏膜以及对应部位的粪便，采用实时荧光定量PCR法对提取的粪便细菌DNA进行检测，并定量分析PCR产物特异性，待分析反应结束之后，由PCR仪分析定量结果。对肠道菌群进行分析，首先过滤并处理原始数据，得到优化的序列; 而后对嵌合体序列加以取出，得到有效序列，然后再进行数据的聚类分析。每一个聚类都是一个操作单元(OTU), 根据聚类统计结果加以样本的多样性指数分析，以及对检测测序的深度进行分析[3]。采用RDP classifier贝叶斯算法进行聚类的代表序列的相似水平分析，将相似水平设置为97%, 并对每个样本的群落组成进行水平统计，然后比对数据库Silva 119 16S rRNA database(https: //www. arb-silva. de/)。

1.3 统计学方法

2 结 果

结肠直肠癌组胆酸、熊去氧胆酸、甘氨熊去氧胆酸、鹅脱氧胆酸、甘氨胆酸、牛磺脱氧胆酸、石胆酸水平显著高于对照组(P<0.05或P<0.01), 见表1。与癌旁组织的粪便肠道菌群微生态相比，癌组织的肠道菌群微生态显著改变(P<0.05)。见表2。

表1 结肠直肠癌组与对照组总胆汁酸、次级胆汁酸水平比较 nmol/mL

与对照组相比, *P<0.05，**P<0.01。

表2 结肠直肠癌癌组织与癌旁组织的肠道菌群微生态比较

肠道菌群以OTUs的相对丰度(每个OUT中序列数的相对百分含量)表示。与癌旁组织相比, *P<0.05。

3 讨 论

结肠直肠癌的发展是多阶段、多步骤的过程，受到多种因素的影响。人体胃肠道蕴藏着一个巨大而丰富的肠道群落，这些肠道菌群对宿主的营养及黏膜免疫功能起着至关重要的作用[4-6]。随着高通量测序技术的发展，有证据[7]表明复杂的肠道微生物群落在肠道肿瘤发生、发展过程中起着重要的作用。最近对肠道菌群与结肠直肠癌的研究[8]发现，结肠直肠癌患者的癌组织肠黏膜和正常人的正常组织肠黏膜肠道菌群结构存在很大差异。本研究提示，结肠直肠癌患者癌组织肠道菌失调的明显特征是丁酸盐产生菌显著减少。丁酸盐具有降低细胞 DNA 氧化损伤、诱导已经出现 DNA 损伤的细胞凋亡、阻断肿瘤组织细胞生长、减弱致癌酶的作用等功能，可降低宿主肠壁的损伤，降低患肠炎和结肠直肠癌的风险。

肠道炎症是罹患结肠直肠癌的重要危险因子。本研究中，结肠直肠癌患者未检测到双歧杆菌。本研究采用半定量PCR检测，结果显示结肠直肠癌患者胆酸、熊去氧胆酸、甘氨熊去氧胆酸、鹅脱氧胆酸、甘氨胆酸、牛磺脱氧胆酸、石胆酸水平较健康体检人群显著升高(P<0.05)。本研究发现在结肠直肠癌的发生、发展中，总胆汁酸和次级胆汁酸表达水平的异常、肠道菌群微生态的改变可能起着重要的作用。