超声辅助提取异叶茴芹多酚的工艺优化

段菁菁 王志新 董琼

[摘要]以异叶茴芹为材料，用有机溶剂乙醇作为提取剂，结合超声波提取法对异叶茴芹多酚进行提取。用单因素实验法分别考察不同提取条件（乙醇浓度、料液比、超声温度及时间）对异叶茴芹多酚提取量的影响，得出单因素最佳提取条件为料液比1：100、乙醇浓度40%、超声时间80min、超声温度60℃。再进行正交实验，筛选多酚提取条件。结果表明，超声辅助提取异叶茴芹多酚最佳提取条件为料液比1：110、乙醇浓度50%、超声时间100min、超声温度60℃。

[关键词]异叶茴芹;多酚;超声辅助提取

[中图分类号]R284.2[文献标识码]A

异叶茴芹（Pimpinella diversifolia DC.）属伞形科茴芹属多年生草本植物，分布广泛，产湖南、浙江、广东、安徽等地，在国外分布于越南、阿富汗、尼泊尔等地。异叶茴芹常生长在山脚下和路边草丛的阴湿处，湿地山沟等地。异叶茴芹被当作一种常见的中草药，有祛除风寒、消除肿痛等功效。可用于医治风寒感冒、咳嗽、结核、痢疾、小儿疳积。也可将新鲜的异叶茴芹磨碎外敷，用于治疗血液循环毒素中毒、化脓性炎症、全身性瘙痒症等。植物多酚是一类具有大分子质量的多元酚类化合物，是广泛存在于植物体内的次生代谢物。多酚含有多种生物活性，可除去机体内过量的自由基，同时起着保护机体内大分子物质的作用。多酚也能够对机体内的脂肪代谢产生重要的作用，可被用于治疗心脑血管疾病。此外，多酚还具有一定的抗肿瘤活性，能够有效地防癌抑癌，有极大的应用前景。尽管目前植物多酚提取的方法多样，所用的植物材料来源丰富，但关于异叶茴芹多酚的提取研究和报道甚少。本实验通过超声辅助提取异叶茴芹多酚，利用单因素实验法考察影响异叶茴芹多酚提取量的主要因素，在单因素实验结果的基础上进行正交实验，得出异叶茴芹多酚提取的最优提取条件，为今后异叶茴芹多酚开发利用提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 仪器和材料

TD5A-WS台式离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司），XY-C电子天平（常州市幸运电子设备有限公司），BJ-150多功能粉碎机（德清拜杰电器有限公司），ZQ6-180R单槽式超声清洗仪（上海争巧科学仪器有限公司），2721G可见分光光度计（上海圣科仪器设备有限公司）。

材料和试剂：异叶茴芹购自浙江省温州市永嘉县。无水乙醇;没食子酸;无水碳酸钠，以上试剂均为分析纯。福林酚试剂（BR级）：1mol·L-1。

1.2 方法

1.2.1 异叶茴芹多酚提取。用粉碎机将干燥的异叶茴芹粉碎，过60目筛，密封保存。称量1g异叶茴芹粉末，加入乙醇溶液，设置不同的单因素实验条件进行超声处理，其中按实验的要求来设定相应的乙醇浓度、料液比、超聲时间和超声温度。在50mL的离心管内加入经超声处理后的提取液后于3000r·min-1下离心10min，待离心机停止运行时，再将离心管内的液体部分倒出，用蒸馏水定容到200mL，得到待测液。室温密封保存。

1.2.2 异叶茴芹多酚提取量的测定。参考张瑛的实验方法稍作修改，称量质量为0.1g的没食子酸纯净粉末，使其溶于70%的乙醇溶液中，定容，得100mL的没食子酸样液。取10mL没食子酸样液，再用70%乙醇定容到100mL，制成标准溶液，其浓度为100?g·mL-1。

取六个10mL容量瓶，依次加入体积为50?L至300?L的没食子酸标准溶液，每份相差50?L。依次加入1950?L至1700?L蒸馏水，每份相差50?L。各加1mL福林酚，混匀，放置5min，此操作过程需要在暗处进行。分别加10%的碳酸钠溶液1mL，混匀后遮光静置2h。760nm下测定吸光值，计算得到线性回归方程。

移取0.5mL待测液置于10mL容量瓶，采用和标准曲线制作相同方法测吸光值，按下式计算：

式中：E代表多酚提取量（mg·g-1），X代表异叶茴芹待测液中多酚的浓度（μg·mL-1），V代表提取溶液定容后的体积（mL），M代表粉末状异叶茴芹的质量（g）。

1.2.3 单因素实验。分别考察料液比（1：80、1：90、1：100、1：110、1：120）、乙醇浓度（20%、30%、40%、50%、60%、70%）、超声温度（40℃、50℃、60℃、70℃、80℃）以及超声时间（20min、40min、60min、80min、100min）对于异叶茴芹多酚提取量的影响。

1.2.4 正交实验。通过之前的实验分析，得到最优的单因素提取数值，再进行L9（34）的正交实验。

2 结果

2.1 没食子酸标准曲线

以吸光度为纵坐标，没食子酸溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线，得到线性方程为y=0.1145x+0.0153，R2为0.9939。

2.2 单因素实验结果

2.2.1 料液比对异叶茴芹多酚提取量的影响。由图1可知，异叶茴芹提取液中的多酚含量随着物料与液体比例的减小呈现出先增大后减小的趋势，在图中横坐标料液比为1：100时对应有最大的多酚提取量。当提取溶剂的体积增大时，异叶茴芹粉末能够与溶剂更充分地接触，促使溶液中的多酚被更充分地提取出来。若提取剂太少，异叶茴芹含有的多酚不能被充分提取出来，当溶剂体积逐渐增大，多酚的提取量也逐渐增大，溶剂到达一定体积时，多酚已被基本提取出来。再继续增大溶剂的体积，不仅会造成溶剂的浪费，也让超声波造成的机械效应变得不再明显，使多酚提取量减少。

2.2.2 乙醇浓度对异叶茴芹多酚提取量的影响。由图2可知，异叶茴芹多酚提取量随着乙醇浓度的增大呈现先升高后降低的趋势，乙醇浓度为40%时，异叶茴芹多酚的提取量最大。多酚易溶于乙醇。逐渐增大乙醇浓度，使得多酚能够充分溶解在乙醇和水的复合体系中。接着增大乙醇的浓度，异叶茴芹多酚的提取量反而降低，是由于一些易溶于水的多酚存在于植物细胞的液泡当中，当乙醇的浓度过大时，蛋白质的空间结构发生改变，蛋白质变性，阻碍了液泡中的多酚被提取，降低了提取液中多酚的含量。

2.2.3 超声温度对异叶茴芹多酚提取量的影响。由图3可知，异叶茴芹多酚提取量伴随超声温度的升高而增大，超声温度达60℃时，异叶茴芹多酚提取量最大，超声温度大于60℃，异叶茴芹多酚提取量开始减少。因为温度升高会使分子的扩散速率加快，导致植物细胞内多酚的提取速率和提取量增大，温度高于60℃，会引起一些聚合反应以及氧化还原反应的产生，使得异叶茴芹的多酚提取量降低。另外，有机溶剂具有挥发性，异叶茴芹中某些其他成分在溶液内的溶解度会伴随乙醇的挥发而增大，影响测量的结果，使得异叶茴芹多酚的提取量降低。

2.2.4 超声时间对异叶茴芹多酚提取量的影响。由图4可知，一定时间范围内，超声时间延长，异叶茴芹多酚提取量增大。超声时间达80min时异叶茴芹多酚提取量最大，在80min后便开始减少。因为异叶茴芹多酚溶出至提取液需要一定时间，当提取时间过短时，异叶茴芹多酚没有被充分提取出来，随着超声时间的增加，多酚提取量不断上升，在超声时间为80min时，异叶茴芹多酚被充分地提取出来。但若超声时间太长，则会因长时间的高温作用，致使多酚的分子构象发生变化，降低提取量，并且也增加不必要的生产成本。

2.3 正交实验结果

设计四因素三水平L9（34）正交实验，如表1所示。从正交实验结果表2中可知，RD>RC>RA>RB，由此可知，异叶茴芹多酚提取量的最大影响因素和最小影响因素分别是超声温度和乙醇浓度。提取异叶茴芹多酚的最优条件为A3B3C3D2。

3 讨论

本实验采用超声波辅助乙醇法从异叶茴芹中提取多酚，得出单因素最适条件为乙醇浓度40%，料液比1：100，超声时间和温度为80min和60℃。进行正交实验最终得到异叶茴芹多酚提取的最佳条件：乙醇浓度50%，料液比1：110，超声时间及温度分别为100min和60℃。其中，对异叶茴芹多酚提取量影响最大的因素是超声温度，影响最小的是乙醇浓度。

本实验选取乙醇和水的复合体系作为提取剂。姚永志的研究表明用乙醇这类有机溶剂比用水作为提取剂的多酚提取率大。且乙醇与其他常见的有机溶剂（乙醚、乙酸乙酯等）相比，对人体的危害较小，成本低，后续废液的收集及处理方便。但浓度过高的乙醇会使蛋白质变性，使得水溶性多酚难以被提取出来，影响多酚的提取量，因此选择浓度适宜的乙醇溶液作为提取剂就尤为重要。本实验初期设置了多个乙醇浓度梯度，浓度分别为20%至70%，组成一组含六个浓度梯度的单因素实验组，重复实验三次得出最佳乙醇浓度为40%。

本实验选择超声辅助提取的办法，超声波可导致植物细胞壁破裂开来，使得异叶茴芹中的多酚更好地渗出，大大提高了提取效率和多酚提取量。有学者在研究中比较了几种植物多酚的提取方法，如李青在研究皇冠梨的多酚提取工艺时，使用了有机溶剂法、微波辅助提取法和超声波辅助法，发现超声波辅助法提取皇冠梨多酚的提取率最高。超声提取比其它提取方法更具优势，其操作程序简单，耗能较少，提取率高，以及操作风险相对较小。因此，在本研究中选择超声波辅助提取的办法。

不同实验材料受提取条件各因素影响的程度不同，刘德明提取金荞麦茎叶中的多酚，发现超声时间为关键影响条件。吕丹提取山楂皮中总多酚，结果表明乙醇浓度对总多酚提取率有最大影响。本实验中异叶茴芹多酚提取量的关键影响因素为超声温度，且在温度为60℃时，异叶茴芹多酚提取量达到最高。随温度升高，提取溶液系统的热能升高，分子热运动速率加快，利于多酚提取。但随超声温度的升高，提取剂中乙醇更容易挥发，影响异叶茴芹多酚的提取，控制超声温度尤为关键。

本实验采用福林酚法测定异叶茴芹提取液中的多酚含量，需要注意控制提取液中多酚与福林酚发生反应的时间，本实验参照实验方案中所及文献，选择反应时间为2h，并统一反应时间，避免造成实验误差过大。本实验虽已对异叶茴芹多酚的超声提取工艺进行一定的优化，但未与其它异叶茴芹多酚提取方法进行比较。另外，本实验主要对异叶茴芹全株多酚进行提取和测定，未对植株不同部位的多酚含量进行深入研究，建议后续工作可尝试多种多酚提取方法，以及比较异叶茴芹不同部位的多酚含量，更合理地開发和利用异叶茴芹。

[参考文献]

[1] 中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志（第五十五卷第二分册）[M].北京：科学出版社，1985.

[2] 危英，张旭，危莉，等.黔产异叶茴芹挥发油化学成分的研究[J].贵阳中医学院学报，2004（01）：62-63.

[3] 董立莎，赵志华.民药异叶茴芹的生药鉴定[J].贵阳中医学院学报，1991（03）：62-64.

[4] 林樱姬，赵萍，王雅.植物多酚的提取方法和生物活性研究进展[J].陕西农业科学，2009，55（06）：105-107.

[5] 张瑛.花生衣多酚的提取、纯化及其活性研究[D].太原：山西大学，2016.

[6] 潘汇.荷叶中多酚类物质的提取，分离及抗氧化构效关系的研究[D].芜湖：安徽工程大学，2018.

[7] 郑贤明.橄榄叶多酚提取纯化及抗氧化活性的研究[D].福州：福建农林大学，2012.

[8] 李华，王蔚新，袁春龙.葡萄籽多酚提取物的提取工艺研究[J].食品研究与开发，2005（06）：69-72.

[9] 郑涛.青杄针叶多酚提取工艺及抗氧化活性研究[D].杨凌：西北农林科技大学，2014.

[10] 姚永志，左锦静，王子涵.乙醇提取花生红衣多酚物质的研究[J].中国油脂，2007（03）：51-53.

[11] 姚永志，王子涵，左锦静.水作溶剂提取花生红衣多酚物质的研究[J].现代食品科技，2006（04）：110-112.

[12] 李青.武威地区皇冠梨中多酚提取工艺优化及其抗氧化性研究[D].兰州：甘肃农业大学，2018.

[13] 刘德明，刘永贤，邓娜，等.金荞麦地上部茎叶中多酚的提取工艺研究[J].现代农业科技，2019（06）：225-227.

[14] 吕丹，唐克慧，王宇弛，等.同步提取山楂皮中总多酚、总黄酮和三萜类物质的工艺优化[J].河南工业大学学报（自然科学版），2018，39（05）：69-75.