术中快速检测甲状旁腺激素的胶体金免疫层析试纸的研制

陈 超，唐振林，杨佳良

(四川省医学科学院·四川省人民医院 a.血管甲状腺外科，b.核医学科，四川 成都 610072)

近年来，我国甲状腺结节尤其是甲状腺癌的发病率快速上升，需要行甲状腺全切除术和(或)颈淋巴清扫术的患者不断增加。部分患者因甲状腺手术中误切、损伤甲状旁腺或因为其血供改变导致了继发性甲状旁腺功能减退，一直是甲状腺术后的严重的并发症，发生率为0.5%～32%[1，2]。临床表现轻者出现手脚发麻、抽搐，重者甚至可危及生命，给患者带来身体和心理上的极大痛苦，同时也给术者带来巨大的工作和心理压力。因此，术中如何准确辨认、识别并且有效保护甲状旁腺来降低术后甲状旁腺功能减退的发生，一直是世界各国研究甲状腺疾病的重要课题。胶体金免疫层析(GICA)技术是一种将胶体金标记技术、免疫检测技术和层析分析技术等多种方法结合在一起的固相标记免疫检测技术，具有简便、省时便捷、采样随意、用量少、结果易判读等特点，已广泛应用于抗原、抗体的检测，以及各种蛋白质、激素及药物等的检测。我院2016年1月至2017年12月利用GICA技术，研制金标免疫层析试剂条，通过术中检测组织液中的PTH，从而快速判断甲状旁腺，操作快捷、简单、实用。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂材料主要仪器：Techcomp离心机，划膜仪、喷金仪、切条机，均来自上海金标生物公司。主要试剂：甲状旁腺激素标准品，BSA-PTH(甲状旁腺激素偶联BSA)购自上海强耀生物科技有限公司；羊抗鼠IgG(15.4 mg/ml)、抗PTH单克隆抗体(15.4 mg/ml)均来自ABCOM公司。材料：硝酸纤维素膜(型号：CNl40)来自赛多利斯(sartorius Stedim)公司；玻璃纤维棉购自上海良信生物科技有限公司；吸水纸由上海金标生物科技有限公司提供。

1.2 制备方法

1.2.1胶体金溶液的制备 采用柠檬酸三钠还原氯金酸法制备胶体金，氯金酸溶液与柠檬酸钠溶液的体积比为100∶150 μl。

1.2.2胶体金标记 采用棋盘法进行筛选。用 25 mmol/L K2CO3溶液调节胶体金溶液pH值分别为7、8、9、10，分别于不同pH值胶体金溶液中加入PTH抗体溶液，震荡混匀20 min，静置30 min，分别加入10 μl的10% NaCl溶液，混匀，静置30 min，观察标记后胶体金溶液颜色的变化，记录其颜色变化差异及变为红色的保持时间，以颜色变化明显的胶体金溶液与抗体溶液的比例为胶体金标记的最佳标记比例，以最佳标记比例下红色保持时间最长的pH值为胶体金标记的最佳标记pH值。

1.2.3胶体金-PTH单克隆抗体结合物的制备 取胶体金，在磁力快速搅拌下加入稀释的抗PTH单克隆抗体，搅拌后，加入牛血清白蛋白(BSA)，再搅拌后离心弃沉淀，上清液再以离心，吸去上清液，沉淀即为胶体金-PTH单克隆抗体结合物，4 ℃保存，备用。

1.2.4金标结合垫的制备 选择玻璃纤维膜作为金标结合垫，将玻璃纤维膜浸泡于0.1 mmol/L pH 8.8 Tris-HCl 缓冲液中5 min，取出，37 ℃烘干。将烘干后的结合垫浸泡于PTE胶体金标记物溶液中，至溶液全部吸收，取出，37 ℃干燥，备用。

1.2.5划膜 硝酸纤维素膜为试纸的检测区，如图1设有质控线(C线)，和检测线(T线)，C线包被15.4 mg/ml羊抗鼠 Ig G和羊抗兔Ig G，T 线分别包被浓度为0.5 mg/ml、1.0 mg/ml、1.66 mg/ml的半抗原 (BSA-PTH)，划膜仪调节划膜量为1 μl/cm，划膜后置干燥间室温干燥过夜。见表1。

表1 划膜3张不同浓度T线的试纸条对比

1.2.6试纸条的组装 将干燥好的硝酸纤维素膜预粘贴于PVC胶板上，确定检测线和质控线的位置，在硝酸纤维素膜上方(C线侧)粘贴吸水纸，吸水纸压住膜约1 mm；在硝酸维素膜下方粘贴金垫，金标垫压住膜约1 mm；在金标垫下方粘贴样品垫，样品垫压住金标垫约2 mm。试纸组装工艺如图1所示。组装完成后按3 mm宽度切为成品小条，装入检测卡盒中即制成胶体金免疫层析试纸条。

图1 试纸条组装示意图

1.3 检测方法

1.3.1加样 将甲状旁腺激素标准品稀释不同浓度，检测试纸条水平放置，取100 μl待测样品滴于加样孔，第10～15 min时判定结果，15 min后的结果无效。

1.3.2结果判读 将待检PTH标准品液滴在试纸条上，如果样品中的PTH低于检测限浓度，则不能竞争抑制金标抗体与包被在硝酸纤维素膜上的BSA-PTH进行第一次免疫反应，金颗粒在硝酸纤维素膜表面沉淀析出形成一条红色条带(T线)，然后其他未结合的金标抗体继续通过毛细作用向前泳动，同样也形成一条红色条带(C线)，这样形成两条红色条带表示样品检测结果为阴性；反之，当样品中含有的PTH高于检测限浓度时，溶解后的金标抗体大部分与样品中的PTH进行第一次免疫反应，仅形成一条红色条带(C线)，表明样品检测结果为阳性。无论样品中有无PTH，测试结果C线位置都应出现红色条带，如果无红色条带出现则表明测试无效。见图2。

图2 PTH胶体金试纸结果判定示意图

2 结果

2.1 胶体金溶液质量鉴定胶体金溶液外观纯净、透亮，无沉淀及漂浮物。采用紫外分光光度计扫描，胶体金溶液最大吸收峰波长为 520 nm，在可见光范围内由单一吸收峰，说明胶体金颗粒比较均匀，大小在20 nm左右。

2.2 胶体金标记条件的确定当pH为8.0，PTH抗体标记量为0.4 mg/ml，胶体金溶液与PTH抗体标记比例为3∶1时，金标溶液稳定，保持红色不变。由此确定胶体金标记抗体的最适pH为8.0。

2.3 样品检测结果从表2可看出，检测线即包被的BSA-PTH浓度在1.66 mg/ml，PTH标准品浓度在1u/ml是，试纸条呈弱阳性，PTH标准品浓度大于10 μg/ml时结果呈阳性，见图3。PTH的最低检测浓度为1 μg/ml，最适T线浓度为1.66 mg/ml。而术中组织液中PTH浓度大于500 pg/ml。本实验结果表明：本试纸可以对甲状旁腺激素准作出定性判定，符合预期目标。

表2 不同样品浓度检测结果

图3 检测阳性结果

3 讨论

对于甲状腺恶性肿瘤，最有效的治疗方法是外科手术，但术中因损伤、误切或影响血供而导致的甲状旁腺功能减退是甲状腺术后最常见的并发症[3]。由于甲状旁腺体积小，其周围有甲状腺、脂肪、淋巴结、肌肉等组织，在术中只能凭经验鉴别，有一定的意外切除率[4]。术中如何显露和识别甲状旁腺，一直是手术的重点和难点，目前国内外尚无一种确切有效的方法，手术医生主要靠主观经验识别甲状旁腺，术中精细化解剖保护甲状旁腺。如遇甲状腺癌需行中央组淋巴结清扫，特别是双侧淋巴清扫，对甲状旁腺的损伤几乎不可避免，尤其是下位甲状旁腺，基本处于淋巴结清扫范围内。目前病理仍是鉴别甲状旁腺的金标准，但这需要切除部分甲状旁腺组织，术中等待时间长、费用高。细针穿刺组织洗脱液的PTH检测，用于术前和术中鉴别甲状旁腺的方法，已有文献报道[5，6]。

人体内只有甲状旁腺分泌PTH，因而甲状旁腺组织中PTH水平远高于血清PTH水平，而周围组织、血液的PTH水平均与血清中PTH水平相当，在血清PTH正常值范围内。Perrier等报道[7]，甲状旁腺腺瘤切除术65例患者行术中细针穿刺抽吸组织液测定PTH，44份细针抽吸腺瘤组织测定PTH值均高于血清中PTH的所能测定的上限值；剩余组织经病理证实不是甲状旁腺组织。2004年Kiblut等报道了在170例患者中进行的前瞻性试验，术中对甲状腺、正常甲状旁腺、增生甲状旁腺组织采用细针穿刺抽吸组织测定PTH并进行了对比，得出了相同的结论[8]。可见，甲状腺术中通过测定组织液的PTH来判定甲状旁腺是可行的。

目前PTH的检测一般是通过电化学发光的方法进行的，需大型的检测设备，加上运送标本，检测时间至少需60 min以上，推广应用在临床上有难度。以胶体金为标记物的GICA技术是以硝酸纤维素膜为固相载体，通过毛细作用使样品溶液在层析条上泳动，并同时使样品中的待测物与层析材料上针对待测物的受体(抗原或抗体)发生高特异性、高亲和性的免疫反应，层析过程中免疫复合物被富集或截留在层析材料的一定区域(检测带)，运用可目测的标记物(胶体金)而得到直观的实验现象(显色)。目前应用最广泛和最成功的是妊娠试验，早早孕试纸条通过检测尿液中人绒毛膜促性腺激素(HCG)以辅助诊断早期妊娠的检验方法，已在家庭和个人中广泛应用。通过本研究表明，通过胶体金免疫层析的方法来检测甲状旁腺激素是可行性的，为外科医生提供了一种快速、准确，且在术中就能实现甲状旁腺定性的鉴别方法，以便于术中更好地保护甲状旁腺，降低患者术后甲状旁腺功能减退的发生率。