Mash-1基因对神经干细胞分化与神经发育的影响研究进展

李泽平， 陈彦霖，李晓苗，焦慧凤

1.南昌大学玛丽女王学院(南昌330031)；2.空军军医大学西京医院(西安 710032)，3.南昌大学生命科学院(南昌330031)

神经干细胞(Neural stem cell，NSC)起源于多能干细胞，具有自我复制和多向分化的潜能，并在学习记忆和海马突触可塑性中起重要作用。Mash-1基因是碱性螺旋-环-螺旋基因(basic helix-loop-helex，bHLH)家族的一类成员。bHLH家族因在一个近60个氨基酸的片段内具有特征性的bHLH序列模式而得名。多种细胞和组织分化发育的过程由此家族调控，对神经发育有重大意义。近年研究表明Mash-1基因对NSC有正性调控作用。作为哺乳动物早期神经发育的关键性基因之一，Mash-1的表达有助于多功能细胞向神经祖细胞分化并产生神经元的过程[1]。此外，bHLH家族中的负性调控基因Hes可以抑制Mash-1的表达，同时bHLH基因也被Notch信号调控。本文对Mash-1蛋白特性和notch、Hes-1对Mash-1通路影响以及Mash-1对神经干细胞发育神经发生予以综述。

1 Mash-1基因及Mash-1蛋白功能特性

Mash-1对哺乳动物的神经发生具有重要意义，敲除这些基因会导致特定神经元亚型的缺失。Mash-1蛋白分子量约为34kD，其具有bHLH结构，可以与启动子E-BOX特异性结合，与E蛋白如E12和E47结合，启动下游基因的转录。有研究表明，Mash-1基因的负调控作用与Id竞争性地和E蛋白结合有密切联系[1]。Mash-1基因在CNS的发育中被Notch介导的一系列信号所调控。而且BMP、ras基因、hedgehog和Wnt通路也可作为其调控神经发育的影响因素[2]。Mash-1除上述互相调控外，通过维持其持续表达可以使BMP诱导NSC向神经元分化，并对BMP-2诱导胶质细胞的分化具有抑制作用。在NSC向神经细胞及中间神经元分化的过程中，MDLX基因可作为Mash-1诱导的靶基因，继而DLX-2诱导谷氨酸脱羧酶67对于GABA能神经元分化产生抑制作用[3]。

2 Notch信号通路对Mash-1基因的调控作用

Notch基因编码的Notch蛋白和Notch配体、DNA结合蛋白、其他效应物[3]以及相关调节分子共同组成了Notch通路在中枢神经系统发育过程里，Notch介导的一系列信号可调控Mash-1基因的转录。研究表明，Mash-1可通过NRSF/REST转录复合物相结合而激活[4]。NRSF/REST是保持神经未分化状态的关键性转录因子，其存在于Notch通路中。

另一方面Notch可以通过调控Hes基因来间接调控Mash-1的表达(见下文)。Notch激活时，其结构发生变化并释放细胞内结构区[2](ICD),该结构区进入细胞核与RBP-J形成复合物。RBP-J可通过结合Hes蛋白的启动子抑制转录，下调Hes1与Hes5表达[4]。但当RBP-J与ICD结合后，则会产生相反的作用。

Delta1(Dll1)的表达被mash-1所调控，Dll1可与相邻细胞的Notch信号结合进行调节[5]。Hes5可以抑制NGND等基因的表达[4],NGND也可调节Dll1的表达。由此也印证了，下一步会分化为原始神经元的细胞Notch信号表达较弱。实验证明[5]，Mash-1对早期室管膜区的神经前体细胞的分化起推动作用，如果Notch信号丢失,神经前体细胞则会缺失,除Notch缺失细胞外，Mash-1均表达正常。

3 Hes基因对Mash-1基因的调控作用

Hes基因是一种负调控型的bHLH转录因子,其作用体现在维持神经干细胞增殖,使大脑细胞具有正确的数目、形态和细胞排列等方面。相反的是正调控型转录因子Mash-1基因,其具有促进神经前体细胞向神经元分化的功能。[6]正调控型和负调控型bHLH转录因子之间拮抗式的互相作用意味着二者共同控制神经干细胞的分化并且决定细胞命运。Hes家族成员高度表达于神经干细胞中(Hes1和Hes5)[4],是Notch通路的靶基因。Hes1和Hes5在早期发育的脑中的异位表达可抑制神经元的分化，维持干细胞数量。然而,在Hes1和Hes5双敲除小鼠中,许多放射状胶质细胞不能维持而提前分化为神经元。[7]Hes家族对于神经干细胞数量维持的重要性对于再生医学有很大意义。亦有研究表明[6]，其对细胞干性也具有影响。

小鼠模型中[7]，Mash-1在胚胎发育极早期有表达,其表达局限在发育中的神经系统中。Mash-1可以对哺乳动物自主神经、嗅神经视网膜以及端脑神经元产生调控。Mash-1与Hes1共表达时,存在能够促进GABA能神经元形成特定情况,但无论Hes1还是Mash-1单独表达则不会产生上述情况。

Hes1的过表达可以抑制Mash-1的转录。Hes因子作用的靶基因包含激活型的Mash-1[4]。通过直接结合到启动子部位而抑制Mash-1基因的表达。因为激活型的bHLH因子可与另一个bHLH激活物E47形成异源二聚体，由此促进向神经元的分化，而Hes1可与E47形成一个非功能性的异源二聚体而抑制正常异源二聚体的形成[8]。综上所述，Hes1通过两个不同的机制而拮抗Mash-1的功能转录水平抑制它的表达，蛋白与蛋白相互作用的水平抑制其活性。

4 Mash-1基因表达对神经干细胞分化发育和神经发生的作用

在ESC维持全能性时，Mash-1基因的转录受到抑制；一旦神经分化发生，Mash-1基因的转录则被上调。敲除Mash-1基因可导致神经发育不全或特定神经元亚型的缺失[9]。

4.1 对干细胞分化发育的积极作用 研究表明[10]，在ESC分化过程中，Hes1基因无明显变化，而Mash-1在分化的细胞中表达，证明了Mash-1在神经发育中具有很大作用，其表达影响待分化干细胞的细胞命运，对干细胞维持是消极因素。

GDNF和IL-1α联合作用可诱导NSCs以较高的比例水平分化成为多巴胺能神经元。荧光定量PCR得出Mash-1基因在分化开始后表达上升，随时间延长表达升高，以实验组尤为显著，Hes1于分化后明显降低，但时长上间比较无显著性差异[6,10]。这一结果即，分化开始后Hes1基因表达降低，减少了与E47的结合，对Mash-1的竞争性抑制作用由此降低，NSCs向多巴胺能神经元分化则受到了促进。同时Mash-1基因的表达可能在细胞因子的诱导作用下随着分化的进程逐步升高，进一步的加强对NSCs的分的促进作用[11]。

谷氨酸能与GABA能的分化是神经元分化过程中与神经发生一起出现的精细调整过程。这个过程可以通过多种因素调节或选择，包括Mash-1在内的神经元基因和(或)同源域转录因子[13]。有丝分裂调节因子在谷氨酸能与GABA能分化中的作用很大，可能具有同Mash-1交互的作用。这些过程背后的因素是不同的[10]，并且可能会在不同的大脑区域有所不同。遗憾的是，在神经系统的不同区域具有不同机制的优点尚不太了解。

另有研究表明[13]，移植的神经干细胞可分化为神经元和星形胶质细胞，并在小鼠PSC中表现出典型的兴奋性和突触反应。可确定EE和Mash-1转导显着影响移植的NSCs向神经元的分化，并抑制NSC分化为神经胶质细胞和抑制性神经元[12]。此外，神经决定基因NeuroD的表达与Mash-1表达正性相关[13]，Mash-1起促进表达的作用。bHLH转录因子Mash-1和Ngn2与神经元分化和NSC存活相关。因此，研究了Mash-1和Ngn2转导对NSCs移植到完整体感皮层的命运的影响，结果表明[13]，Mash-1和Ngn2转导的NPCs在成人受体体感皮层移植后增强了成熟神经元分化并抑制了体内的胶质分化(尽管该研究中实验组和对照组之间的差异仅在Mash-1转导的NPC中达到显着性)。

另外有报道[14]在诱导Mash-1表达后，体外培养的NPC向神经元分化显着增强。表达Mash-1的移植NPC在成年大鼠大脑中产生大的移植物，移植Ngn2转导的NPC也增强了神经元产量和供体细胞存活[15]。有研究发现逆转录病毒介导的bHLH转录因子Ascl1(Mash-1)的过度表达改变了增殖的成体海马干/祖细胞后代的命运，从而导致以牺牲新生神经元为代价的少突神经细胞系的排他性生成[16]。而Mash-1诱导的神经球培养系统中体外抑制性神经元的分化也归因于bHLH转录因子之间的补偿和交叉调节机制[17]。

4.2 中枢神经系统的影响 在中枢发育层面，Mash-1在腹侧端脑和腹侧双眼蛛内的特定区域中以高水平表达。在没有Mash-1的情况下，这些前脑区域内的组织形态、增殖和基因表达被破坏[18-19]。Mash-1对腹侧前脑结构正常发育是必须的[12]。先前的研究已经表明，基因Mash-1的小鼠突变体在自主神经系统的嗅觉上皮和神经节中显示严重的神经元损失，表明Mash-1在周围神经系统中神经元谱系的发育中发挥作用。Mash-1突变小鼠呈现严重的祖细胞丢失，尤其是内侧神经节隆起的室下区中的神经元前体。随后随发育失去基底神经节和大脑皮层的离散神经元群体。对Mash-1功能的候选效应子的分析揭示Notch配体Dll1和Dll3以及Notch信号传导Hes5的靶标不能在Mash-1突变腹侧端脑中表达[18]。因此，Mash-1是腹侧端脑神经发生的重要调节因子，它需要既指定神经元前体又控制其产生的时间。

4.3 周围神经系统的影响 在周围神经系统中的研究表明[20]，Mash-1具有促进神经嵴细胞(Neural crest stem cell，NCSC)分化为自主神经元的关键功能。NCSC在体外培养时，加有诱导性生长因子会导致特异性细胞系产生，可以表现为BMP2上调Mash-1的表达促进自主类神经发生[21]。近年有大量研究指出[22-23]，Mash-1过表达有助于神经再生修复。采用鼠干细胞病毒将Mash-1基因转染CE3小鼠胚胎干细胞稳转株的实验证明了过表达Mash-1基因可促进CE3细胞在脊髓损伤部位分化成神经元，可促进脊髓损伤的修复[22]。

5 展 望

临床层面上，研究[24]指明Mash-1也在肿瘤和中枢疾病中有影响。而这些机制有待进一步详细考证。中枢低通气综合征(CCHS)和哈达德(Haddad)综合征已被证实与Mash-1相关[25]。作为新生儿，Mash-1 (+/-)杂合子小鼠表现出对高碳酸血症的呼吸机反应受损。Mash-1的人直系同源基因已被作为CCHS的候选基因进行了研究[26]。2例CCHS患者(10.5%，2/19)和1例Haddad综合征患者(9.1%，1/11)发现HASH-1突变[27]。这与神经发生的过程是否具有联系还尚无定论。《Cell》杂志的一篇文章指出：“Achaete-scute复合体1(Ascl1/Mash1)作为启动神经重新编程的转录因子。它促使神经祖细胞和非神经元细胞退出细胞周期，并通过激活神经靶基因促进神经分化，即使是那些通常被抑制的基因[28]。”虽然有很多值得注意的地方，但Ascl1的外源性过表达，单独或结合其他因素，作为一种治疗脑损伤和癌症的方法，可能值得进一步考虑。而在神经退行性疾病中bHLH家族的神经再生意义也是未来的探讨方向之一[29]。

神经组织再生能力的研究已超过一个世纪。在神经生物学中，对神经干细胞自我更新和分化调控机制的研究更有意义。目前已经了解包括Mash-1在内的有多种分子机制参与神经干细胞的自我更新和分化调控，包括转录因子、表观遗传、miRNA调控子和细胞外信号等[21]。这些细胞内在基因表达和外界环境因素构成复杂的调控网络，共同调节神经干细胞的自我更新和分化。现在神经干细胞的临床研究还处于起步阶段，对于其基因分子水平的研究以及对再生医学临床化还存在很多问题[21]。Mash-1基因表达水平在干细胞分化与维持波动和其意义还有待详细探讨。