FcγRIIB下调在肾虚型类风湿关节炎B细胞活化中的作用❋

刘 茜，彭珊琴，赵连宇，师晓毅，李美林，徐燕萍，陈炜坚，陈光星

(1.广州中医药大学，广州 510405；2.广州中医药大学第一附属医院，广州 510405)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是最常见的自身免疫性炎性关节病，其关节的毁损严重影响患者的生存质量。大量证据提示，遗传因素参与RA的发生[1]。中医学认为肾为先天之本，主骨生髓，肾虚是RA发病的重要原因，与骨质破坏密切相关[2]。B细胞的来源及分化发育均在骨髓之中，其免疫失耐受后会产生大量自身抗体，从而激发免疫炎症，影响RA的发病[3]。研究证实，B细胞上抑制性IgG受体(FcγRIIB)可诱导产生活化抑制信号，通过负反馈限制B细胞的活化增殖[4-7]，且FcγRIIB的基因缺陷与RA关节破坏密切相关[8-9]。相较于健康对照组，肾虚型RA患者B细胞免疫失耐受与FcγRIIB在记忆B细胞及前浆细胞上表达下调密切相关[10-11]。本文通过分析肾虚型RA患者B细胞活化标志与FcγRIIB的表达情况，初步探索FcγRIIB在肾虚型RA中的作用机制。

1 材料与方法

1.1 病例资料

表1显示，选取 2017年9月至2018年4月期间在广州中医药大学第一附属医院风湿科就诊的57名RA患者，其中女性患者44名，男性患者13名，男女比例为1∶3.38，接近RA性别发病比例；年龄25～70岁，平均年龄(53.79±10.23)岁；病程1～48年，平均病程(7.95±7.89)年。其中肾虚型患者27例，非肾虚型患者30例，2组患者在性别、发病年龄及病程方面比较差异无统计学意义(P>0.05)。该研究获得广州中医药大学第一附属医院伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。

表1 2组RA患者人口学特征比较

1.2 诊断标准

1.2.1 肾虚诊断标准 根据1986年5月全国中西医结合虚证与老年病研究专业委员会修订的《中医虚证辨证参考标准》[12]和国家中医药管理局1994年发行的《中医病证诊断疗效标准》[13]中的诊断依据：腰脊酸痛(除外伤性)胫酸软或足跟痛；俯仰不利；发脱或齿摇；尿后有余沥或尿失禁；性功能减退，不孕不育；肢寒畏冷 ；神倦懒动。以上8条标准，符合5条及以上者辨证为肾虚证，不满足辨证为非肾虚证。

1.2.2 RA诊断标准 根据2009年美国风湿病学会(ACR)制定的RA诊断标准[14]。

1.3 纳入标准

符合RA诊断标准或前期确诊后的RA患者；入组年龄大于16岁，发病年龄小于71岁；签署知情同意书。

1.4 排除标准

合并心脑肾呼吸系统及其他免疫类疾病或不适宜参与临床研究的患者。

1.5 检测及方法

1.5.1 自身抗体水平与疾病活动情况 清晨抽取患者空腹肘静脉血2 mL，类风湿因子(RF)、抗CCP抗体(ACPA)、红细胞沉降率(ESR)与C-反应蛋白(CRP)均由广州中医药大学第一附属医院检验科完成，结果RF>20 IU/mL、ACPA>5 U/mL、CRP>8 mg/L、ESR>20 mm/h判定为阳性。疾病活动度评分 (Disease activity score，DAS28 scores)[15]分别以ESR(DAS28 ESR scores)和CRP(DAS28 CRP scores)计算。

1.5.2 流式细胞学检测 提取PBMC：真空EDTA抗凝管抽取患者空腹肘静脉血2 mL，将新鲜全血与1640培养液(Gibco,31870074)1∶1混匀，缓慢加在相等比例的人外周血淋巴细胞分离液(天津灏洋生物制品科技有限责任公司，货号LTS1007)液面上，1500 r不间断离心20 min后全血混合物分层；吸出单个核细胞层，重悬于4倍体积1640培养液中，2300 r不间断离心10 min，获得细胞；细胞重悬于1 ml完全培养基(1640培养液、10%血清(Gibco, 10099141)、青链双抗(Gibco,15140122))，计数后铺板(24孔板)；加入F(ab')2 fragment goat anti-human IgM(catalog 109-006-129,Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.)10ug/ml刺激培养48 h。

1.5.3 流式细胞学染色并检测 流式管中依次加入Anti-Human CD19-PE-Cyanine5 (eBioscience, 85-15-0199-42) 5 μl、Anti-Human CD27-FITC(eBioscience,85-11-0279-42)5 μl、Human CD32 PE FL18.26(BD Pharmingen,550586)20 μl、Human CD86 PE-Cy7 2331(BD Pharmingen,561128) 5 μl抗体与收取的细胞混合荧光染色后上机检测。记录RA患者B细胞亚群上FcγRIIB与CD86荧光表达率及平均荧光强度(MFI)。CD32b是FcγRIIB基因蛋白表达，CD86是B细胞活化的协同共刺激分子，是B细胞表面活化的标志，B细胞活化后其表达增加[16-17]。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 2组RA患者疾病活动情况及自身抗体水平

表2显示，2组RA患者疾病活动情况(压痛关节数、肿胀关节数、ESR、CRP、DAS28ESR和DAS28CRP)比较差异无统计学意义(P>0.05)。而肾虚型患者ACPA水平高于非肾虚型患者，且RF低于非肾虚型患者，2组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表2 2组RA患者疾病活动情况及自身抗体水平比较

2.2 2组患者外周血不同亚群B细胞分子标志的表达情况相似

图1显示，以CD19标记B淋巴细胞， CD27的不同表达群划分幼稚B细胞(CD19+ CD27-)、记忆B细胞(CD19+ CD27+)及前浆细胞(CD19+ CD27high)[18]。 对2组患者不同亚群B细胞分子标志的表达情况进行分析，2组在幼稚B细胞、记忆B细胞及前浆细胞表达上无差异(P=0.469[1 A]，P=0.294[1B]，P=0.062[1C])。

注：①B细胞分群示意图; ②幼稚B细胞及记忆B细胞分子标志表达; ③前浆细胞分子标志表达图A.幼稚B细胞；图B.记忆B细胞；图C.前浆细胞；与非肾虚组RA比较：P>0.05图1 2组患者外周血不同亚群B细胞分子标志的表达情况

2.3 肾虚型RA患者幼稚B细胞活化程度更高

图2显示，在IgM刺激培养后，肾虚型RA患者CD86的表达率明显偏高(P=0.000)(2 A)；而2组在记忆B细胞及前浆细胞上CD86表达无差异(P=0.891[2B]，P=0.177[2C])。

注：①非肾虚型RA患者幼稚B细胞活化分子表达情况; ②肾虚型RA患者幼稚B细胞活化分子表达情况图A.幼稚B细胞；图B.记忆B细胞；图C.前浆细胞；与非肾虚组RA比较：***P< 0.001图2 2组患者外周血不同亚群B细胞活化分子标志CD86的表达情况比较

2.4 肾虚型RA患者幼稚B细胞FcγRIIB分子标志表达强度降低

图3显示，在IgM刺激培养后，肾虚型幼稚B细胞FcγRIIB的MFI较非肾虚型患者低(P=0.026)(3 A)；而2组在记忆B细胞及前浆细胞上FcγRIIB的MFI无差异(P=0.932[3B]，P=0.833[3C])。

注：与非肾虚组RA比较：***P< 0.001图4 2组患者不同亚群B细胞之间FcγRIIB分子标志表达变化比较

注：与非肾虚组RA比较：**P< 0.01图5 肾虚型RA患者记忆B细胞上FcγRIIB分子标志表达水平与ACPA抗体滴度比较

2.5 肾虚型RA患者从幼稚B细胞到记忆B细胞的FcγRIIB分子标志表达存在下调

图4显示，肾虚型RA患者记忆B细胞的FcγRIIB表达率明显较幼稚B细胞低(P=0.000)(4 A)，而非肾虚型RA患者无此差异(P=0.278)(4B)。但2组前浆细胞的FcγRIIB表达率都明显较幼稚B细胞、记忆B细胞低(P<0.05，4AB)。

2.6 肾虚型RA患者记忆B细胞FcγRIIB分子标志表达水平与自身抗体水平相关

图5显示，根据Syversen SW等[19]研究，将ACPA≥200U/ml判定为高滴度阳性(高危)。57名患者中ACPA实际检测人数肾虚组26人，非肾虚组30人。肾虚型RA患者记忆B细胞上，高滴度ACPA人群FcγRIIB的表达率明显较低滴度人群低(P=0.004，5A)，而非肾虚型RA患者无此差异(P=0.624，5B)，提示肾虚型RA患者 FcγRIIB下调与其自身抗体分泌升高有关。

3 讨论

类风湿关节炎患者B细胞的免疫失耐受与其关节及软骨的破坏密切相关[20]。目前在RA的针对性治疗中，对B细胞的抑制治疗往往具有良好的疗效[21]。

中医学认为肾虚是RA发病的关键内因，同时也是推动疾病发展的重要因素。动物模型[22]与临床研究[23-24]证实，肾虚型RA小鼠及患者关节肿胀程度、滑膜增生情况、软骨及骨质的破坏方面都有明显的加重。肾主骨生髓，与现代医学的胸腺功能密切相关。B细胞在骨髓中分化及发育成熟，且B细胞表面的抑制性受体FcγRIIB能够从骨髓的分化发育阶段开始对B细胞进行调节。本研究通过分析B细胞表面活化标志分子CD86与B细胞表面抑制性受体FcγRIIB分子标志CD32b表达情况，证实肾虚型RA患者存在FcγRIIB水平的下调，且相较于非肾虚型RA患者，肾虚型RA患者B细胞亚群的处于更加激活的状态。

Mackay M[4]等研究发现，在SLE患者幼稚B细胞转变为记忆细胞的同时，未能及时上调FcγRIIB的表达，导致其记忆B细胞表面的FcγRIIB表达明显低于正常对照组，并在正常机体B细胞活化后，FcγRIIB抑制性受体表达增加能够与IgG免疫复合物结合并形成一个反馈抑制环，从而维持体内抗体稳态[5,7,25]。本研究发现，相对于非肾虚型RA患者，肾虚型RA患者从幼稚B细胞到记忆B细胞的FcγRIIB表达率存在下调，这可能与肾虚型RA患者机体反馈抑制环的破坏相关。

部分中医风湿病学家，如朱良春、焦树德等[26-27]从中医学理论肾主骨生髓出发，提出肾虚会导致肾脏功能的紊乱，进而造成关节与骨的破坏。然而目前对于肾虚与RA关节破坏相关，及对肾虚型RA的从肾论治仍然缺乏理论支持。众所周知，ACPA作为RA特异性极高的抗体[28]，是由RA患者B细胞自发分泌的，而其他免疫性疾病及健康人群的B细胞则不分泌该抗体。近年来研究表明，RA患者血清中自身抗体水平的高低与关节的破坏程度相关[29]。虽然ACPA滴度高低与患者疾病活动度无关[29-31]，但却可能会对RA患者关节破坏的速度及强度产生影响[29]。本研究发现，肾虚型RA患者记忆B细胞、FcγRIIB的表达率与ACPA滴度的高低有关，ACPA水平越高，其记忆B细胞的FcγRIIB表达率越低，提示除了病因以外，FcγRIIB的下调能够导致自身抗体水平的升高，进而使肾虚型RA患者产生更加严重的骨质侵蚀与破坏。

综上所述，肾虚型 RA患者存在FcγRIIB水平的下调，能够促进B细胞过度活化和自身抗体水平升高，与其关节破坏程度有关，这一研究为临床从肾论治类风湿关节炎提供理论支持。