黄芪甲苷预防性给药对PM2.5诱导大鼠急性肺损伤病理结构的影响❋

王振兴，王智超，吴雨潇，张 秀，肖 玮，李水芹，王 飞△

(1. 成都中医药大学临床医学院，成都 610075； 2. 曲靖市中医医院，云南 曲靖 655000； 3. 成都中医药大学附属医院，成都 610075)

急性肺损伤(acute lung injury，ALI)是多种炎症细胞介导的肺脏局部炎症反应和炎症反应失控所致的肺泡上皮细胞及毛细血管内皮细胞损伤[1]。近年来，随着全球工业化和城市化建设的迅速发展，环境空气污染成为新的全球疾病主导因素之一[2-3]。大气污染特别是由于细颗粒物(fine particulate matter，PM2.5)所导致的雾霾天气在全国各地区频繁发生，已严重影响到公民的健康和生活质量[3-5]。

黄芪是豆科多年生草本植物蒙古黄芪或膜荚黄芪的干燥根，黄芪甲苷是其主要质量控制成分[6]，具有较好的免疫调节、器官保护、抗炎和调节细胞凋亡等作用[7]。课题组前期将PM2.5视作中医病因学中环境毒邪范畴[8]，并探讨了益气解毒法防治PM2.5所致疾病的有效治法[9]。本次研究采用PM2.5标准品气管滴注染毒诱导ALI模型，造模前给予不同剂量黄芪甲苷进行预防，并运用HE染色、McGuigan病理评分、透射电子显微镜观察黄芪甲苷对PM2.5所致ALI模型的早期形态学变化影响，探讨黄芪甲苷对PM2.5诱导ALI的保护作用。

1 材料

1.1 实验动物

健康SPF级SD雄性大鼠40只，体质量150～180 g，购自成都达硕实验动物有限公司(合格证号SCXK(川)2015-030)。实验经成都中医药大学伦理委员会批准(编号：2017-03)，在成都中医药大学中医脏腑病证实验室分笼饲养。全程SPF级环境喂养，自由饮食饮水，饲养温度(25±1)℃，湿度(55±5)%，12 h昼夜交替，动物福利按照国际相关实验动物法规实施。

1.2 主要试剂与仪器

细颗粒物标准品SRM 2786(美国NIST)，黄芪甲苷(中国曼斯特，HPLC≥98.81%)，4%多聚甲醛(中国Bioshap)，DMSO(美国Sigma)，光学显微镜(日本NIKON)，透射电镜(日本Hitachi)。

2 方法

2.1 细颗粒物及黄芪甲苷的配制

细颗粒物标准品SRM 2786购于美国国家标准与技术研究所，具体成分组成及成分分析详见官网信息库。使用前将SRM 2786溶解于生理盐水，配置成SRM 2786混悬液，经超声15 min振荡混匀后使用。黄芪甲苷溶解于1‰DMSO的生理盐水中，制成混悬液现配现用。

2.2 分组给药及造模

大鼠适应性饲养3 d后，按照随机数表法分为假手术组、模型组及黄芪甲苷低、中、高剂量组(12.5，25，50 mg·kg-1)各8只。ip给药，每日2次，连续给药3 d[10-11],假手术组给予等体积溶剂。造模方法参考文献及预实验结果[12-13]，造模前12 h禁食，末次给药30 min后，SRM2786混悬液气管滴注(剂量为7.5 mg·kg-1b/周；每只大鼠滴注体积按1.5 ml·kg-1b/周计算；每日1次，隔日滴注1次，共计2次)诱发大鼠ALI模型。假手术组气道滴注等体积生理盐水，末次滴注0.5 h后[14]，右股动脉放血处死大鼠。

2.3 大鼠一般状况和肺组织形态学观察

实验期间，全程详细观察记录各组大鼠的饮食状况、呼吸状况、精神神态、被毛光泽和活动度等指标，记录大鼠死亡情况。处死大鼠后，肉眼观察肺瘀血和肺肿胀程度。

2.4 HE染色及McGuigan病理评分

取每只大鼠右侧肺脏尖叶，经4%多聚甲醛固定48 h，酒精脱水，二甲苯透明，制成石蜡切片，切片厚度4 μm备用，经HE染色后观察病理改变。ALI程度判定采用McGuigan病理评分法[15]，根据肺泡充血、出血、肺泡腔或血管壁中性粒细胞浸润或聚集、肺泡壁增厚或透明膜形成，分别进行0～4分半定量分析。0分：无病变或非常轻微；1分：轻度病变；2分：中度病变；3分：重度病变；4分：极重度病变。McGuigan病理评分由两位病理科医师盲法判定评分结果。

2.5 透射电镜观察超微结构

取0.1×0.1×0.1 cm3右侧中叶肺组织，即刻放入滴有三氯乙醛固定液的载玻片上，用载玻片轻压肺组织直到小气泡消失为止。将组织固定24 h后，用pH 7.0的PBS清洗样本3次，每次15 min。然后用1%锇酸溶液固定样品2 h，去除固定液，第二次用pH 7.0的PBS漂洗样品3次，每次15 min。随后用不同浓度的乙醇对样本进行脱水处置，每种浓度浸润15 min后再用10%的乙醇浸润 20 min，最后用100%丙酮浸透。丙酮和包埋剂混合，按1∶1比例将样品在混合液中浸润1 h，70 ℃下过夜。将处理好的肺组织切成厚度为50 nm的切片，并用枸橼酸铅及醋酸双氧铀染色，用透射电镜观察肺组织全貌、局部和细胞器，重点观测各实验组肺泡上皮细胞、肺泡巨噬细胞的超微结构。

2.6 统计学方法

3 结果

3.1 大鼠一般情况和肺组织形态学观察

所有大鼠实验期间无死亡。麻醉苏醒后，假手术组大鼠呼吸平稳，精神活动恢复快，爪甲嘴唇无发绀和分泌物，对外界刺激反应正常，有进水现象。与假手术组比较，模型组大鼠活动量明显降低，出现皮毛直立现象、精神萎靡、反应迟钝、胸腹部喘息明显等，偶有喘鸣音，唇舌黏膜发绀，鼻部有少量黑色粉末状分泌物，无进水进食。与模型组比较，黄芪甲苷各剂量组大鼠的活动量、皮毛色泽、唇舌黏膜等一般状况均有改善，无胸腹部喘息，鼻部可见少量黑色粉末状分泌物，偶有皮毛直立现象，其中黄芪甲苷中、高剂量组精神较好，偶有饮水。

肉眼观察肺组织，假手术组两肺外观呈现淡粉红色，颜色均匀，包膜完整，质地软、弹性好，无瘀血点和肿胀。模型组两肺肿胀，颜色暗红，双肺弥漫分布深红色出血点，在肺表面出现明显瘀血和水肿，质地相对粗糙。黄芪甲苷低、中剂量组与模型组比较，双肺颜色较假手术组较深，体积略膨大，偶见散在出血点，但瘀血、水肿程度有所降低；黄芪甲苷高剂量组双肺呈粉红色，基本无出血点和瘀血，双肺的损伤程度在给药组中最轻。

3.2 各组大鼠肺组织HE染色结果

假手术组肺泡大小正常未见充血，肺组织基本未见出血，肺泡腔和血管壁可见少量中性粒细胞，未见肺泡壁增厚。模型组可见肺泡充血增多，肺组织明显出血，肺泡腔和血管壁明显可以观察到中性粒细胞浸润，肺泡壁明显增厚。黄芪甲苷各剂量组肺泡和肺组织基本未见出血，肺泡腔和血管壁中中性粒细胞浸润。其中，低剂量组肺泡腔和血管壁中中性粒细胞程度比中、高剂量组增多，低剂量组肺泡壁一定程度比高剂量组增厚，与中剂量组无明显差异。

3.3 各组大鼠肺组织McGuigan病理评分结果

与假手术组比较，模型组病理总积分显著升高(P<0.01)，其中肺泡充血、出血、肺泡壁增厚或透明膜形成3项积分比较差异有统计学意义。与模型组比较，黄芪甲苷各剂量组病理总积分均显著降低(P<0.01)，其中中、高剂量组在中性粒细胞炎性浸润或聚集上明显优于低剂量组(与低剂量组比较，P<0.01)。此外，各给药组肺泡结构较完整，基本无出血现象，其中高剂量组效果最优(与模型组比较，P<0.01)，中剂量组与低剂量组病变程度相似。

注：A.假手术组；B.模型组；C.黄芪甲苷12.5 mg·kg-1组；D. 黄芪甲苷25 mg·kg-1组；E. 黄芪甲苷50 mg·kg-1组(图2同)图1 各组大鼠肺组织病理HE染色结果比较(×100)

3.4 各组大鼠肺组织超微结构观察结果

假手术组显示，细胞结构较完整，肺泡上皮细胞排列整齐，边缘清晰，无肿胀，无炎性浸润，无明显基底膜增厚，细胞核呈圆形；偶见肺泡巨噬细胞，细胞边缘清晰，细胞内线粒体呈现杆状，双层膜结构正常，线粒体内嵴排列完整，未见肿胀或变形。

表1 实验药物对大鼠肺组织McGuigan病理评分影响比较

注：与模型组比较：*P<0. 05，**P<0. 01；与假手术组比较：▲P<0. 05，▲▲P<0. 01；与黄芪甲苷低剂量组比较：◆◆P<0. 01

图2 各组大鼠肺组织超微结构比较(×25000)

模型组可见，肺泡上皮细胞结构紊乱、坏死、脱落，细胞质内部分板状小体溶解呈排空状，细胞核边缘不完整，呈现不规则外形，甚至呈现核固缩现象；肺泡巨噬细胞较假手术组增多，细胞器内可见黑色颗粒物，线粒体肿胀明显，线粒体体积较假手术组增加，甚至形成巨型线粒体，部分内嵴断裂、消失或颜色变浅，内皮外基膜不完整。

黄芪甲苷各给药组超微结构较为类似，肺泡上皮细胞边缘完整，体积略增大，细胞质均匀，板层小体空泡化少，肺泡腔内脱落的炎性细胞较少，渗出物较少，细胞核较完整；高剂量给药组低较、中剂量给药组在肺泡巨噬细胞数量上明显减少，细胞器内可见黑色颗粒物，线粒体体积较假手术组相似，但低剂量给药组线粒体内嵴偶见断裂，内外基本偶见不完整。

4 讨论

PM2.5所致肺损伤是环境因素致病的典型代表，是呼吸系统疾病的研究热点。PM是指悬浮在环境空气中固体及液体颗粒的总称，按其空气动力学直径分为超细颗粒物(PM0.1，≤0.1 μm)、细颗粒物(PM2.5，≤2.5 μm)以及粗颗粒物(PM10，≤10 μm)三类。一般来说，PM2.5具有更小的粒径，并可吸附多种有机物、重金属、病原微生物、酸性氧化物，故可以随呼吸运动进入到下呼吸道，深达肺泡，甚至进入血液循环，导致呼吸系统及其他系统病变发生。大量流行病学研究显示，PM2.5浓度升高所介导的肺损伤与呼吸系统疾病住院率、病死率密切相关[16]。长期暴露在PM2.5的环境中，可以显著增加慢性阻塞性肺疾病、支气管哮喘、肺癌、肺纤维化等呼吸系统疾病的发病风险[17]。因此，深入研究PM2.5所致肺系疾病的发病机制及如何运用中医药进行防治，在当下具有重要价值。

ALI是以肺微血管通透性增高引起的以肺泡-毛细血管受损为主要特征的急性炎症性疾病，其主要病理学表现是急性肺水肿[1]。效应细胞反应失调是目前研究较为深入的病理机制[18]。研究显示[19]，作为肺组织的主要防御者，肺泡上皮细胞和肺巨噬细胞损伤、功能紊乱在PM2.5刺激所诱导的ALI过程中扮演着重要角色。一方面[20]，肺泡上皮细胞在PM2.5的诱导下导致肺泡表面活性物质减少、耗能增加，导致细胞凋亡，是肺水肿形成的重要原因。在此过程，中性粒细胞在肺内被激活，释放大量炎性介质、活性氧和蛋白酶加重肺水肿的形成。另一方面[21]，作为人体肺部的“清道夫”，肺泡巨噬细胞作为接触和沉积PM2.5的重要靶器官，具有识别和吞噬PM2.5的重要作用。PM2.5可严重影响肺泡巨噬细胞的吞噬功能，造成肺功能障碍；不仅如此，肺泡巨噬细胞与PM2.5中所吸附的重金属接触后会导致促炎因子分泌的增加，引起肺泡巨噬细胞和肺上皮细胞的炎症作用[22-23]。

与模型组比较，黄芪甲苷各给药组能有效减轻ALI的肺泡充血、出血，减少中性粒细胞的浸润和聚集，降低肺泡壁增厚或透明膜的形成。在肺损伤McGuigan病理评分上，与模型组比较，黄芪甲苷高剂量较低、中剂量组在肺损伤病理积分上具有统计学意义。此外，黄芪甲苷各给药组还能保护肺泡上皮细胞和肺泡巨噬细胞的超微结构，保护前者的包膜完整性，降低后者在肺内的聚集数量。通过以上结论可以推测，黄芪甲苷“益气解毒”保护PM2.5诱导ALI可能的主要机制在于改善肺微血管通透性的基础上，减少肺泡充血、出血，降低炎性细胞浸润、黏附、迁移和激活；减轻失控的炎性因子对肺泡上皮细胞屏障的破坏，降低肺微血管的通透性；调节肺泡表面活性物质，减轻肺泡巨噬细胞的吞噬障碍，从而减轻巨噬细胞的免疫损伤。总之，本次实验在中医学治未病思想的指导下，宏观与微观相结合，证实了黄芪甲苷能有效改善PM2.5诱导大鼠的生存状态，减轻肺水肿和肺组织McGuigan病理评分，从而实现预防PM2.5所致ALI的目的，这为临床防治PM2.5提供了新的思路。