细菌外膜囊泡发生机制的研究进展*

陈桥桥 涂仕娟 夏修文 丁 斗,2 杨红亚

1.成都中医药大学基础医学院，四川 成都 610075；2.遵义医药高等专科学校中医系，贵州 遵义 563002

外膜囊泡(outer membrane vesicles，OMV)是由革兰氏阴性细菌释放的一种特定的生理结构，其为纳米级大小、球形、双层膜包裹的，内含生物活性蛋白、脂质、核酸和代谢物的囊泡状结构。几乎所有的革兰氏阴性细菌均能产生外膜囊泡[1-2]，但物种的多样性使它们在包膜结构和组成上存在一定的差异性[3-4]。OMV的释放可去除细菌细胞内不必要的物质，同时也是细菌抵御外界应激压力的一种手段，这对细菌的存活至关重要[5-6]。OMV的脱落被认为是细胞间通讯的一种普遍机制，通过OMV释放将其携带的货物递送到其他细菌或真核细胞中，从而在细胞相互作用中发挥多种关键作用，如营养摄取、抗菌防御、水平基因转移、生物膜形成以及毒力因子递送等[1,7-8]。OMV作为免疫刺激剂被认为是一种有前景的疫苗成分，OMV相关疫苗的开发近年来受到广泛的关注[1,7,9,35]。细菌正常生长和受应激时，都会释放OMV，但其发生机制目前尚不清楚。了解OMV的生物发生机制及其影响因素，对充分认识OMV在细菌生理学、致病机制及相关疫苗研发中具有重要意义。

1 OMV生物发生模型的提出

目前，关于OMV的生物发生机制研究主要集中于以下几种模型。

1.1 外膜与肽聚糖间交联的减少

革兰氏阴性细菌的细胞壁由外膜(OM)和肽聚糖(PG)组成，周质间隙位于细胞膜(内膜)和外膜间，周质间隙内的一薄层肽聚糖连接内外两层膜。Lpp是含量丰富的外膜脂蛋白，共价交联OM和PG层，维持包膜结构的完整性。当PG分解-合成平衡改变时，局部Lpp-PG交联被破坏，外膜的一小部分向外凸出，导致囊泡的产生[10-11]。Schwechheimer C等[10]发现OMV的产生受PG重塑和Lpp-PG交联的调节，且 OMV的产生水平与Lpp-PG交联呈反比关系。大肠杆菌nlpI突变体在产生高水平OMV时，共价OM-PG交联率明显降低(P<0.05)[11]。这些观察均支持一个模型，即OMV在OM-PG交联水平局部降低的位点出芽。

1.2 周质间隙中错误折叠蛋白或包膜成分的累积

Schwechheimer C等[10]同时也发现OMV产生并不完全取决于Lpp-PG交联。在一些高囊泡性菌株中，OMV产生与Lpp-PG交联之间并不呈反比关系，而在细菌周质间隙中出现错误折叠蛋白或包膜成分的积累，他们推测囊泡的产生是由这些材料的累积引起的[10]。Mcbroom A J等[6]的研究表明囊泡释放的量与包膜中蛋白积累的水平直接相关，且在细胞的正常管家和应激反应机制受损时积累加剧。这些物质积聚在周质间隙的某些区域后，将外膜向外挤出而出芽，从而去除不需要的细胞成分。

1.3 脂质A修饰引起的LPS重塑

革兰氏阴性细菌的OM双层脂质组织为独特的不对称结构，内部小叶和外部小叶分别由甘油磷脂(PL)和LPS构成，脂质A是LPS生物活性的主要组分[12]。Wael E等[13]发现脂质A脱酰酶PagL的表达引起囊泡增多，而pagL突变株的OMV合成减少，且较之OM，仅OMV中出现脱酰脂质A的积累。Bonnington K E等[14]激活PhoP / Q-和PmrA / B系统，同时诱导向OM添加修饰的LPS物种后，OMV产量增加，且直径增大[14]。OM中具有共价修饰的脂质A物种被保留，而棕榈酰化脂质A物种选择性丧失[14]。这些证据表明OMV生物发生的机制涉及脂质A修饰引起外膜重塑，导致外膜弯曲和随后的OMV形成。

1.4 内部或外部小叶脂质的富集

Kolds H等[15]提出脂质聚集与膜曲率相关，特定脂质的聚集会导致OM双层表面的局部弯曲。球体的曲率为半径的倒数，细菌若要形成高度弯曲的OMV，其不对称OM小叶的曲率必须增大很多倍。基于此，Gui M J等[16]提出细菌形成OMV，必须在OMV的内部和外部小叶之间，形成具有较大差异的脂质的量或类型，并证明这能通过上调内/外部单侧小叶脂质的产生来实现。OM外表面选择性富集具有适应曲率能力的A-LPS和CTD-家族蛋白，A-LPS的去酰化进一步增加曲率，导致OM局部向外弯曲形成OMV[16]。内部或外部小叶脂质的富集，可能导致单层区域的不对称，从而增加整个双层的固有曲率，导致膜弯曲。

1.5 其他模型

除上述模型外，有关 OMV生物发生还提出了以下几种模型。(1)假单胞菌喹诺酮信号(PQS)的膜分布调节模型。Florez C等[17]发现铜绿假单胞菌PQS输出与OMV产量密切相关，同时还检测到OMV释放少的菌株隔离了内膜中大部分PQS。这表明OMV形成与PQS信号输出有关，PQS嵌入外膜导致外部小叶扩张，由此引起曲率并最终形成OMV[17]。Horspool A M等[18]证实小分子PQS诱导OMV生物发生是一个广泛保守的过程。(2)磷脂(PL)在OM外部小叶的累积产生OMV。有证据表明PL转运蛋白对于维持OM脂质不对称必不可少[12,19]。Sandro R等[20]报道VacJ / Yrb ABC转运系统(一种拟议的PL转运蛋白)参与了OMV的生物发生。PL转运蛋白突变体的OMV中富含PL[20-21]。磷脂在OM外部小叶中不对称扩张引起OM向外膨胀，导致OMV的产生。(3)Hampton C M等[22]发现创伤弧菌OMV是以与荚膜多糖(CPS)相关的空间差异方式产生。他们观察到野生型创伤弧菌OMV在细胞周围形成一系列平面同心环，并与膜保持约200 nm的间距，透射电子显微镜显示OMV边缘有厚约100 nm的荚膜存在，SPRF进一步揭示多糖链之间端对端相互作用，维持细胞-细胞、细胞-OMV以及OMV-OMV之间观察到的200 nm间距[22]。

2 影响OMV生物发生的因素

OMV的产生并不是膜简单剪切的物理过程，而是一种将生物分子分选到OMV中的能量消耗过程[16]。尽管OMV生物发生的分子机制还不是非常清楚，但已有大量的证据表明，OMV的生物发生受到细菌生长条件和遗传因素的影响。

2.1 生长条件

细菌OMV的产生是一种受环境控制的特定的分泌过程。物理刺激如高温、渗透压等，生化刺激如抗生素、环氧化物等，以及限制生长所需的营养元素如氧气、氨基酸等，均会对OMV的生成产生一定的影响[3]。抗生素对OMV产生的影响涉及产量、尺寸、毒力因子及蛋白成分等多方面[23-24]。反过来，OMV通过这些改变在抗生素应激下对细菌起到防御保护作用[25]。Chan K等[26]发现铁限制会导致OMV蛋白质组显著变化。有研究表明外膜囊泡在铁限制条件下可充当铁供体[27]。这也揭示了囊泡在铁获取中的重要作用，这对于宿主的存活是至关重要的。值得注意的是，细菌产生OMV并不限于特定的生长条件，在宿主体内也会产生；也并非受应激才生成，即使在没有外部应力的情况下，OMV也要释放。

2.2 遗传因素

OMV生成和内容物选择是受基因调控的，并不是随机发生或细胞死亡的结果[2]。在大肠杆菌OMV表型的转座子突变体筛选中，发现nlpA突变体比野生型产生更少的OMV， 而degP、nlpI突变体产生更多的OMV[5,11]。degQ基因缺失可增强奥奈达湖杆菌OMV产生[28]。virK基因突变导致志贺氏菌OMV的温度依赖性过量产生[29]。变形链球菌分选酶A缺乏引起突变膜囊泡的蛋白质谱发生改变[30]。霍乱弧菌OmpA突变体比野生型释放更多的OMV[31]。fumA和tktA突变导致土拉弗朗西斯菌OMV产生的严重缺陷[32]。这些研究均表明OMV生物发生可以在遗传水平上进行调控。

OMV生物发生影响因素的研究，提示外膜囊泡对细菌存活的重要作用。关于目前OMV生物发生的模型，需作出以下几点说明：首先，每种模型都是在对一种或几种细菌OMV研究的基础上提出的，此细菌物种成立的模型并不一定适用于彼物种，正如荚膜多糖调控OMV生物发生的机制，目前为止仅在创伤弧菌野生型菌株中观察到；其次，同一细菌OMV的生物发生可能不止对应一种模型，可能存在OMV生物发生的多种途径，比如检测到异质囊泡的某些物种[33-34]；最后，现有的发生模型未能涵盖全部革兰氏阴性菌OMV的生物发生机制，其还有待进一步的研究和深入。

OMV纳米级大小、坚固的双层结构以及远距离递送活性分子等特点，赋予了它被用于疫苗开发的可能。大量证据表明OMV作为针对广泛细菌感染的疫苗，具有很大的潜力[35]。然而，对OMV生物发生认识的不足限制了对它的大规模生产，且病原体衍生的OMV的过度毒性阻碍了它们的临床应用。因此，许多研究专注于囊泡工程化设计，以便OMV能更好地递送药物和抗原，从而改进目前的抗菌药物治疗方法。总之，革兰氏阴性菌OMV的生物发生，关系到未来新抗生素或基于OMV的疫苗开发。揭示OMV生物发生的机制，将促进OMV生物工程在生物技术和生物医学中的应用。关于OMV的形成及其产生水平和内容物选择间关系等，虽然还存在诸多问题，但进一步探索具有良好特征的模型系统，可能会在未来有所见解。