无精症和少精子症患者的细胞遗传学和分子遗传学检测

张志英

郑州大学第三附属医院检验科，河南省郑州市 450052

调查显示，近年来我国男性不育发生率呈逐年上升趋势，严重影响患者的正常生活。相关资料显示，多种因素均会引起男性不育，其中30%以上为染色体异常和基因突变所致[1]。本文以近年来本院所收治无精症和少精子症患者300例作为观察对象，对其进行细胞遗传学分析和分子遗传学分析，旨在探讨无精症和少精子症患者中遗传性缺陷的分布特点。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2015年1月—2017年12月本院收治的无精症和少精子症患者300例，均符合WHO相关诊断标准：精液常规分析中镜检未见精子即为无精症；精子密度在20×106/ml以下者即为少精子症。入选患者均已排除合并输精管阻塞者、激素水平异常者、泌尿生殖道感染者。患者年龄20～45岁，平均年龄(30.4±5.9)岁；其中包括135例无精症，165例少精子症。

1.2 方法

1.2.1 细胞遗传学分析：取患者外周血淋巴细胞0.5ml，在肝素抗凝后在RPMI-1640培养液中接种，并置于37℃中培养72h，按照常规操作流程进行染色体的培养、收获和G显带，在镜检中中期分裂相细胞数目在20个以上即为培养成功，对5个核型进行分析。

1.2.2 分子遗传学分析：(1)提取DNA：取外周血样2ml在EDTA抗凝管中保存，采用天根生化科技有限公司所生产全血基因组提取试剂盒进行DNA抽提，并采用紫外分光光度计对DNA含量进行测定。(2)遗传因子缺失检测：采用多重PCR技术对7个序列表达标签位点进行检测，包括AZFa区(sY255、sY254位点)、AZFb区(sY134、sn27位点)、AZFc区(sY255、sY254位点)、AZFd区(sn52位点)，同时以ZFX/ZFY和SRY作为对照组，对上述序列进行扩增，所用引物为上海生工生物公司提供，按照涂向东等报道中所提出的方法进行相关操作。Y染色体AZF因子缺失判断：根据正常男性Y染色体AZF因子分布，与受检片段进行对比。其中若待检标本所有位点均出现扩增则视为无缺失；待检标本在部分位点在单独扩增和多重PCR中均未出现产物则视为存在缺失。

2 结果

2.1 核型分析 由表1数据可知，300例不育症男性中共计存在51例核型异常，占总体的17.00%。其中，无精症中存在29例核型异常，异常核型均为(47，XXY)，占整体的21.48%。少精子症中存在22例核型异常，占整体的13.33%。

表1 300例不育男性核型分析结果

2.2 AZF微缺失 由表2数据可知，300例不育男性中共计检出AZF微缺失28例，占整体的9.33%。其中，135例无精症患者中共计检出AZF微缺失13例，占无精症整体的9.63%；165例少精子症患者中共计检出AZF微缺失15例，占少精子症整体的9.09%。

表2 300例不育症男性AZF微缺失检测结果

3 讨论

染色体核型分析是男性不育患者的重要筛查指标，相关资料显示，染色体异常因素是最为常见的男性不育原因[2]。在本文中，135例无精子症患者中共计检出29例核型异常，均确诊为Klinefelter征，异常率为21.48%。此类患者主要为先天性曲细精管发育异常，导致其失去生育能力，并造成第二性征发育不全。既往研究证实，Klinefelter征主要为卵子在形成过程中X染色体未能成功分离，从而导致受精卵出现染色体异常。异常X染色体造成患者睾丸功能异常，生殖器发育不良，从而造成精子发育障碍[3-4]。本文中，165例少精子症患者中共计出现22例核型异常，占整体的13.33%，其中以染色体平衡易位为主。相关资料显示，染色体易位可造成不对称单价体、多价体的产生，导致精母细胞分化异常，无法正常形成精子。除X染色体异常外，Y染色体上基因结构不完整也是造成男性不育的重要原因。本文中，4例[46，X,inv(Y)]型核型异常患者中，Y染色体倒位造成其结构异常，从而引起精母细胞未能正常分化。2例45,X(7)/46,X,r(Y)(37)核型异常患者则为Y染色体畸变所致结构异常，又被称为环状Y染色体，此类染色体异常导致相关基因缺失，从而引起少精症。

Kleiman SE等研究指出，15%左右男性不育患者为Y染色体上AZF区域微缺失所致。其中，对于AZFa区域缺失患者，在临床主要表现为睾丸体积缩小，从而造成精子生成异常；AZFb区域缺失则会造成精母细胞无法正常分化，从而引起无精症；AZFc区域。AZFd区域缺失则会造成精子数量异常或精子分化异常。随着近年来临床医疗技术的不断进步，AZF区域微缺失检测已成为男性不育基因诊断的必备措施。300例不育男性中共计检出AZF微缺失28例，占整体的9.33%，其中26例分布于AZFc、AZFd区域。相关资料显示，AZFc、AZFd区域接近高度重复异染色质区域，此区域Y染色体稳定性较差，造成遗传物质丢失风险升高。

需要注意的是，染色体核型异常和AZF微缺失可能同时存在，或仅存在单一类型[5]。因此，对于少精子症、无精症等男性不育患者，不仅需要对其进行细胞遗传学检查已确定染色体核型异常，同时需采用分子生物学方法对其Y染色体上AZF微缺失状况进行测定，从而取得明确的遗传学诊断结果，确定精子异常原因，为临床治疗和干预提供可靠依据[6]。

综上所述，染色体核型异常和Y染色体AZF区域微缺失是造成男性不育中少精子症和无精症出现的重要原因，对患者进行细胞遗传学核型分析和分子生物学检测，以明确不育症原因，对于临床治疗的开展具有十分重要的意义。