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子宫肌瘤患者孕激素受体的表达及意义

2019-01-30薛小芳王玉王利霞崔娟李森森许振峰

实验与检验医学 2019年1期
关键词:缓冲液平滑肌肌瘤

薛小芳,王玉,王利霞,崔娟,李森森,许振峰

(南阳南石医院妇产科,河南 南阳 473000)

子宫肌瘤的整体发病率较高,在年龄大于45岁的育龄期女性人群中,子宫肌瘤的发生率可达235~545/1万人左右[1]。现阶段临床上主要通过手术治疗子宫肌瘤,但包括各种方式综合性治疗后的子宫肌瘤患者的复发率仍然较高,远期二次手术的风险仍然超过5%[2]。

在不同的生物学分子机制中,受体水平的改变能够促进平滑肌细胞DNA的扩增,促进平滑肌瘤的发生。孕激素受体(progesterone receptor,PR)的激活能够诱导平滑肌细胞DNA持续性扩增,促进平滑肌细胞的增殖和间质成分的增生,促进肌瘤的形成[3,4]。PR-A/B是传统的PR,其在促进PR受体的激活、平滑肌细胞的纤维化等方面发挥了重要的作用;PR-M是新型的PR,近年来相关研究发现PR-M能够通过影响平滑肌细胞的线粒体代谢活性,促进ATP能量利用的增加等,显著促进平滑肌细胞的增殖和间质成分的代偿性增生[5]。为了进一步揭示PR-M、PR-A/B等因子与子宫肌瘤平滑肌细胞增殖的关系,本次研究选取2017年1月至2017年12月我院保存的子宫肌瘤组织标本21例,探讨了不同亚型受体的表达。

1 材料与方法

1.1 组织来源 选取2017年1月至2017年12月我院保存的子宫肌瘤组织标本21例,年龄34~46岁,平均年龄(41.24±8.46)岁。同时选取距子宫肌瘤>5cm正常子宫平滑肌组织作为对照,纳入标准:⑴行子宫全切手术;⑵未绝经妇女;⑶多发性子宫肌瘤<5个;⑷患者知情同意。排除标准:⑴术前3个月服用过类固醇激素类药物;⑵伴有其他内分泌合并症。

1.2 实验方法

1.2.1 免疫组化染色 石蜡切片脱蜡至水,过氧化氢封闭内源性过氧化物酶:3%H2O2,室温10min(避光),10mMpH 6.0 枸橼酸钠缓冲液),PBS 冲洗5min,滴加正常山羊或兔血清封闭处理,37℃,15min。用滤纸吸去血清,不洗,直接滴加第一抗体,37℃ 2h, 滴加生物素化的二抗,37℃,40min,PBS冲洗5min,DAB显色,苏木素复染,加拿大树胶(或中性树胶)封片。

PR以细胞核呈棕黄色为阳性,随机选取5个高倍镜视野对细胞染色强度和阳性细胞比例进行评分,两种评分之和≥3分为阳性表达。染色强度:无色为0分,淡黄色为1分,棕黄色为2分,棕褐色为3分;阳性细胞比例:<10%为0分,10%~30%为1分,31%~60%为2分,>60%为3分。

1.2.2 仪器与试剂 DMEM、DMEM-F12培养基(Hyclone公司),胎牛血清(杭州四季青公司),青霉素、链霉素、胰蛋白酶-EDTA、PBS、Ⅰ型胶原酶(索莱宝公司),SP试剂盒、DAP染色试剂盒(北京中山金桥公司)。

1.2.3 细胞分离、培养 使用10%的完全培养基进行培养,放置于37℃、5%CO2培养箱中,培养24~48h待细胞贴壁(融合度80%左右)进行第1次换液,以后每2~3d更换一次培养基,采用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化传代。

1.2.4 CCK-8检测 在96孔板中接种细胞悬液(100μL/孔),向每孔加入 10μl CCK8 溶液,将培养板在培养箱内孵育1~4h,用酶标仪测定在450nm处的吸光度,若暂时不测定OD值,可以向每孔中加入10μl 0.1M的HCL溶液,24h内测定,吸光度不会发生变化。

1.2.5 Western blot检测 采用组织研磨法研磨子宫平滑肌组织,冰上放置30min,进行Bradford比色法检测平滑肌瘤组织的蛋白浓度,采用BSA缓冲液配比(1:4),加入电泳缓冲液(比例 1:1),上样、电泳(浓缩胶20mA,分离胶35mA),电转膜仪转膜(100mA 40min),10%的高脂蛋白封闭,加入养来源一抗(1:1000),封闭 4h,PBS 缓冲液洗涤 3次,每次 5min,加入鼠来源二抗(1;2000),PBS 缓冲液洗涤3次,每次5min,采用AP/NBT显色法,进行常规的曝光和胶片的灰度读取。

1.3 统计学处理 统计分析采用SPSS 19.0软件,计量资料采用()表示,组间比较使用t检验;计数资料采用χ2检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 子宫肌瘤和正常子宫平滑肌标本PR表达比较 子宫肌瘤组织PR阳性表达率明显高于正常子宫平滑肌组织(P<0.05),见表 1和图 1。

表1 子宫肌瘤和正常子宫平滑肌标本PR表达比较

图1 免疫组化图

2.2 子宫肌瘤和子宫平滑肌细胞PR-A、PR-B、PR-M表达比较 子宫肌瘤细胞PR-A、PR-B、PRM蛋白相对表达量明显高于子宫平滑肌细胞 (P<0.05)。 见表 2。

表2 子宫肌瘤和子宫平滑肌细胞PR-A、PR-B、PR-M蛋白表达(,n=6)

表2 子宫肌瘤和子宫平滑肌细胞PR-A、PR-B、PR-M蛋白表达(,n=6)

细胞 PR-A蛋白相对表达量子宫肌瘤子宫平滑肌PR-B蛋白相对表达量PR-M蛋白相对表达量t P 0.762±0.116 0.341±0.120 6.179<0.05 0.987±0.107 0.543±0.112 7.021<0.05 0.097±0.042 0.010±0.002 5.068<0.05

2.3 不同PR表达类型子宫肌瘤细胞增殖情况比较 筛选出仅表达PR-M的细胞株 (PR-M阳性组)和仅表达PR-A/B的细胞株(PR-M阴性组)进行CCK-8实验,PR-M阳性组培养24h、48h OD值明显高于PR-M阴性组,差异具有统计学意义(P<0.05)。 见表 3。

表3 不同PR表达类型子宫肌瘤细胞增殖情况比较(,n=6)

表3 不同PR表达类型子宫肌瘤细胞增殖情况比较(,n=6)

组别 0h PR-M阳性组PR-M阴性组t P 0.211±0.087 0.204±0.090 0.137>0.05 24h 48h 0.352±0.097 0.234±0.071 2.404<0.05 0.411±0.091 0.301±0.089 2.117<0.05

3 讨论

不同的生物学因子机制均可以促进平滑肌细胞再生和纤维化等病理改变的进程,提高子宫肌瘤的发生风险。但现阶段临床上因子宫肌瘤导致的子宫切除率明显上升,同时子宫肌瘤的持续性进展率、复发率等指标仍然较高[6,7]。一项包括了261例子宫肌瘤患者的治疗随访研究提示,临床上子宫肌瘤手术治疗后的肌瘤复发率、肌瘤变性的风险可超过7%[8]。而通过对于子宫肌瘤发病过程中PR受体水平的相关分子亚型的分析,具有下列几个方面的意义:⑴能够为临床上子宫肌瘤患者的生物学靶向治疗提供理论基础;⑵能够为子宫肌瘤高危人群的筛查提供依据。

PR受体与雌激素信号通路具有一定的交错式的激活效应,PR受体水平的激活不仅可以通过激活PR下游信号通路,还能够通过增加雌激素下游转录调控机制的激活程度,促进雌激素对于平滑肌细胞的促增殖作用[9,10]。PR-A/B作为主要的PR受体亚型,其在子宫肌瘤发病过程中的作用已经得到了多数研究的证实,而关于PR-M的分析研究不足。基础方面的研究提示,PR-M主要定位于线粒体膜周边,其与配体结合后导致的线粒体转录活性的增加,能够促进ATP能量利用率的上升,提高平滑肌细胞的代谢水平,促进平滑肌细胞的增殖[11,12]。同时,PR-M受体亚型的改变,还能够提高平滑肌增殖过程中局部新生血管形成的速度,提高病灶部位血流灌注水平。

本次研究首先通过免疫组化分析探讨了PR的表达情况,发现PR的整体表达水平明显上升,提示PR能够参与到子宫肌瘤的病情进展过程,PR主要通过影响到受体信号通路的激活效应,促进平滑肌细胞的增殖和间质成分的代偿性增生过程。免疫组化染色分析可见,PR蛋白主要染色于平滑肌细胞较为密集的区域,特别是在间质成分增生明显、平滑肌细胞形态改变较为显著的区域,PR的染色强度更深,PR的表达阳性率更高。汪伟等[13]研究者也认为,PR在子宫肌瘤患者病灶组织中的表达阳性率可平均上升25%,同时在复发率子宫肌瘤或者巨大型子宫肌瘤病灶组织区域中,PR的上升更为明显。在细胞水平进行蛋白的表达分析研究,发现子宫肌瘤细胞PR-A、PR-B、PR-M蛋白表达量均明显高于普通的平滑肌细胞,差异较为明显,提示了PR-A、PR-B、PR-M蛋白均参与到了平滑肌细胞的增殖和子宫肌瘤的形成过程,不同的受体亚型的变化,对于子宫肌瘤细胞的形成和增殖状态的维持作用,主要由于其对于细胞代谢水平的改变或者细胞周期的调控作用有关,但具体的机制仍然要增加样本量、设立基础研究对照组进一步分析。最后本研究发现,PR-M阳性组培养24h、48h OD值明显高于PR-M阴性组,OD值的提升提示了PR-M阳性组子宫肌瘤细胞的增殖活性较高,表明PR-M对于子宫肌瘤细胞具有显著的促增殖作用,其促增殖活性明显强于PR-A、PR-B组,这主要由于PR-M能够直接影响到平滑肌细胞的内部细胞器的代谢、提高线粒体的能量代谢活性[14-16]。

综上所述,子宫肌瘤组织以及细胞PR表达升高,其中PR-M蛋白可能与子宫肌瘤细胞增殖有关,值得进一步研究。

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