改良微柱凝胶法检测ABO变异型血型

朱碎永，金方思，施顺秋，裘晓乐，郑婷婷

（温州医科大学附属第二医院育英儿童医院 输血科，浙江 温州 325027）

ABO血型系统是临床上最重要的血型系统，它在输血、生物学、遗传学、法医学和人类学等方面被广泛应用[1-2]。常见ABO血型有A、B、O、AB 4种表型，人群中也发现一定数量的ABO变异型，这些ABO变异型血型表现为凝集强度改变或正反定型不一致，用盐水试管法和微柱凝胶血型卡检测易出现漏检现象[3-6]。为提高微柱凝胶法的检测敏感度，避免出现漏检，本研究通过改变微柱凝胶法离心方式，增加孵育时间，调整孵育温度，建立改良微柱凝胶法，现报告如下。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2016年11月至2018年5月温州医科大学附属第二医院育英儿童医院、温州市人民医院和瑞安市人民医院ABO血型凝集强度改变或正反定型不一致的患者12例，男7例，女5例，年龄21～69岁。本研究经本院伦理委员会批准，血液采集均征得本人及家属的知情同意。

1.2 试剂和仪器 ABO血型定型血清（北京金豪生物试剂有限公司、上海血液生物医药有限责任公司）；抗A抗H（上海血液生物医药有限责任公司）；A、B、O试剂红细胞（江苏力博生物技术有限公司）；1%O型混合红细胞20例（本课题组自制，每例取3份同1名献血员红细胞混合后洗涤4次）；基因组DNA提取试剂盒、基因分型检测试剂盒和人类红细胞类孟买血型基因分型检测试剂盒（天津秀鹏生物技术开发有限公司）；微柱凝胶血型卡（ABO、RhD血型抗原检测卡，江苏力博生物技术有限公司）；医用低速离心机（江苏力博生物技术有限公司）；PCR扩增仪（美国ABI公司）；3730基因测序仪（美国ABI公司）；医用冷藏箱（青岛海尔特种电器有限公司）。所有试剂均在有效期内使用。

1.3 方法

1.3.1 ABO血型检测：ABO正反定型采用单克隆抗A、抗B血型定型试剂、ABO标准红细胞进行盐水试管凝集法检测；H抗原用抗H血清盐水试管凝集法检测。

1.3.2 ABO血型复核：将待测标本用0.9%氯化钠溶液配制成1%红细胞悬液，加入微柱凝胶血型卡腔中，置离心机，按说明书要求离心，观察结果。

1.3.3 吸收放散试验：取待测标本压积红细胞1 mL，用0.9%氯化钠溶液洗涤3次后加入等量抗A或抗B血清，4 ℃吸收1 h，0.9%氯化钠溶液洗涤3次（末次洗涤液检测不到抗体），加入1/2体积0.9%氯化钠溶液，置56 ℃放散10 min，离心取放散液，加A或B型试剂红细胞离心检测[7]。

1.3.4 分子生物学鉴定：用DNA试剂盒对标本进行基因DNA提取，用序列特异性引物-聚合酶链式反应（sequence specific primers polymerase chain reaction，PCR-SSP）法进行基因分型，严格按照其仪器试剂说明书进行。

1.3.5 改良微柱凝胶法建立：①离心方式的调整。取1% O型红细胞悬液50 μL加入微柱凝胶血型卡中，900 r/min分别离心0.5、1、1.5、2、2.5、3 min，使红细胞进入抗血清中而不进入凝胶中为最适离心时间1，分别置4 ℃冰箱15、30、45、60 min，1500 r/min分别离心2、2.5、3、3.5、4 min，红细胞全部进入凝胶底部的最短时间为最适离心时间2。②孵育温度的选择。选IgM抗体和ABO血型抗原反应最适温度4 ℃为孵育温度。③孵育时间的确定。取1%已知ABO变异型血型标本红细胞50 μL加入微柱凝胶血型检测卡中，900 r/min最适离心时间1离心，分别置4 ℃冰箱15、30、45、60 min，1 500 r/min最适离心时间2离心，以最短时间凝集最强者为最适孵育时间。

2 结果

2.1 患者ABO血型血清学和基因检测 对12例凝集强度改变或正反定型不一致的标本，采用血型血清学检查及部分标本血型基因检测结合临床表现确认其ABO血型，结果显示，12例标本中A3亚型1例，B（A）型3例，A类孟买型（Amh）1例，B类孟买型（Bmh）2例，A抗原减弱3例，B抗原减弱2例。见表1。

2.2 微柱凝胶法复核 全部标本用微柱凝胶血型卡检测，同盐水试管法比较，2种方法检测敏感度相似，在12例标本中只检出1例A3亚型和1例B（A）型红细胞上的A抗原，检出比例为2/12。见表1-2。

2.3 改良微柱凝胶法的建立

2.3.1 确定离心方式：对20例O型标本测试确定孵育前离心时间为900 r/min离心2 min，4 ℃孵育后1 500 r/min离心3 min。

2.3.2 确定孵育时间：对1例A3亚型和1例A抗原减弱标本红细胞进行检测，4 ℃孵育15、30、45、60 min检测敏感度分别为±、1+、1+、1+，重复测试10次，结果一致。可见，4 ℃孵育30 min是理想的最短有效时间。

2.3.3 改良微柱凝胶法的确立：取50 μL 0.8%～1%待检红细胞加入微柱凝胶血型卡中，900 r/min离心2 min，置4 ℃冰箱孵育30 min，1 500 r/min离心3 min。

2.4 改良微柱凝胶法检测 全部标本用改良微柱凝胶法进行检测，检测结果显示，改良微柱凝胶提高了检测敏感度，12例标本中仅1例B抗原减弱检测不出来，检出比例为11/12。见表2。

表1 12例患者ABO血型血清学和血型基因检测结果

表2 12例患者血清标本微柱凝胶法和改良微柱凝胶法检测结果

3 讨论

AB亚型、B（A）型、类孟买型、ABO抗原减弱型等ABO变异型均以抗原性弱为主要特征的ABO血型表型。在实验室常规盐水试管检测中，ABO变异型红细胞上ABH抗原凝集非常弱或检测不到[8-9]。本研究12例标本中1例标本抗A血清检测为混合凝集反应，难以判定血型；8例标本用抗A、抗B血清不能检测出A或B抗原，血清中不能检测出相应的抗体，正反定型不一致；1例标本抗A混合凝集反应，抗B强凝集，反定型检出弱抗A，正反定型不一致，难以判定血型；2例标本抗A血型检测不凝集，抗B强凝集，反定型检出弱抗A，最容易检测为B型。为确定ABO血型，本研究对12例标本做吸收放散试验和H抗原检测，以确定标本红细胞上A、B和H抗原的存在，部分标本进一步检查血型基因确定其ABO血型。然而对临床急危重患者紧急用血时，吸收放散试验操作繁琐、费时，需经验丰富的操作人员操作；基因检测操作更是复杂、耗时，这严重影响临床及时输血治疗和输血安全。经吸收放散试验和H抗原检测结合部分基因检测，本研究中12例标本血型分别为A3亚型1例，B（A）型3例，A类孟买型1例，B类买孟型2例，A抗原减弱3例，B抗原减弱2例。可见，常规盐水试管法难以胜任ABO变异型血型的筛查。微柱凝胶法能很好地把血型血清学技术与凝胶分子筛技术有机结合起来，具有操作简便、易于自动化、标准化、结果可靠、特异性强、易于保存和核对等优点，早在20世纪初欧美发达国家已将其作为常规红细胞血型血清学检测技术应用于临床[10-11]，国内一些医院和血站在2000年左右开始用微柱凝胶法检测ABO、RhD血型[12-14]。目前，微柱凝胶法检测ABO、RhD血型已在市县级甚至于镇级医院开展。然而该法在常温下进行，微柱凝胶柱内抗血清量有限（15 μL左右），且抗血清分布高度只有2～3 mm，故离心时红细胞与柱内抗血清实际接触时间极短，鉴定时，如红细胞上相应抗原位点减少，红细胞和红细胞之间来不及搭桥就直接被离心到柱底，因此敏感度不是非常高，抗原减弱型和亚型可出现漏检[15-17]。本研究中12例ABO变异型血型用上述2种方法检测发现，微柱凝胶法和常规盐水试管法检测敏感度相似，检出比例为2/12，与文献报道[18-19]相同，显然微柱凝胶法也不适合于ABO变异型血型的筛查。

为提高ABO变异型血型的筛出率和尽量减少操作难度和时间，必须运用操作简便而敏感度高的检测方法。林海芬等[20]用加入抗血清的方法来提高检测ABO血型的敏感度，此法虽能检出ABO抗原减弱血型，但只能应用于已知个别标本的检测，不能用于批量标本的鉴定。为此，本研究通过改变微柱凝胶法离心方式，增加孵育时间，调整孵育温度，建立改良微柱凝胶法，使抗原和抗体在最适温度下有较长的反应时间，以提高检测敏感度。本研究中12例ABO变异型标本用改良微柱凝胶法检测，结果显示，1例A3亚型、3例B（A）型、3例A类孟买型、3例A抗原减弱型和1例B抗原减弱型均检出A或B抗原，仅1例B抗原减弱型检测不出B抗原，检出比例高达11/12，明显高于微柱凝胶法和常规盐水试管法2/12的检出比例。可见，改良微柱凝胶法通过延长孵育时间、调整孵育温度，使抗原和抗体在最适反应温度下有较长的反应时间，提高了对ABO变异型血型的检测敏感度。

综上所述，改良微柱凝胶法不改变微柱凝胶血型卡组成成分和批量标本的检测，仅通过改变微柱凝胶血型卡的离心方式，增加孵育时间，调整孵育温度，提高了检测敏感度，适合ABO变异型血型的筛检。