β-蜕皮甾酮对激素性骨质疏松大鼠血清骨代谢指标及骨密度的影响

汤样华，辛大伟，李国松，岳振双，曾林如

（杭州市萧山区中医院 骨科，浙江 杭州 311201）

骨质疏松症是以全身性骨量减少，单位体积骨量降低，矿盐和骨基质比例减少，骨组织微观结构退化为特征的疾病[1-2]。骨质疏松症主要包括原发性、继发性和特发性3种类型，其中糖皮质激素诱导的骨质疏松症是继发性骨质疏松症的最常见形式[3]，并因此导致骨密度（bone mineral density，BMD）降低和骨折风险增加。骨质疏松症属于中医“痿证”范畴，病变在骨，其本在肾，以补肝肾、强筋骨为治则。牛膝为苋科植物牛膝的干燥根，归肝、肾经，具有活血化瘀、补肝肾、强筋骨的作用。其中β-蜕皮甾酮（β-ecdysterone，β-Ecd）为牛膝的活性成分之一，本课题组前期研究发现[4]，β-Ecd能以剂量依赖性的方式逆转地塞米松对成骨细胞分化、增殖的抑制和减少成骨细胞凋亡。目前BMD的测定和骨代谢生化指标检测是骨质疏松症的主要诊断手段。本研究通过使用泼尼松龙（prednisolone，Pred）诱导构建骨质疏松症大鼠模型，采用β-Ecd进行干预处理，观察其对大鼠血清骨代谢指标及BMD的影响，进一步探讨β-Ecd治疗糖皮质激素性骨质疏松症的疗效和作用机制。

1 材料和方法

1.1 材料 β-Ecd购自上海纯优生物科技有限公司；泼尼松龙缓释片购自郑州灵瑞制药有限公司；阿仑膦酸注射液购自石家庄英创医药科技有限公司；枸橼酸钠溶液购自上海Jrdun生物技术有限公司；2%牛血清白蛋白购自美国Sigma-Aldrich公司；Micro-CT及分析软件购自瑞士SCANCO医疗公司；CX41RF显微镜购自上海巴玖实业有限公司；70-70型全自动生化分析仪购自日本日立公司。

1.2 方法

1.2.1 实验分组：30只清洁级雄性Wistar大鼠[由上海实验动物中心提供，许可证号：SCXK（沪）2016-0004]，鼠龄4周，体质量180～220 g。所有大鼠被安置在25 ℃（湿度60%～70%）的环境中，光/暗周期为12 h，可自由获取食物和水。将大鼠随机分为5组，每组6只。

1.2.2 动物造模和给药：对照组：未接受任何干预治疗；Pred组：在大鼠后背皮下埋入1粒泼尼松龙缓释型药片（2.5 mg/粒）[5]，连续4周；Pred+β-Ecd（5 mg/kg）组：在Pred组用药的同时，皮下注射β-Ecd（5 mg/kg），周一到周五，每日1次，连续4周；Pred+β-Ecd（10 mg/kg）组：在Pred组用药的同时皮下注射β-Ecd（10 mg/kg），周一到周五，每日1次，连续4周；Pred+阿仑膦酸（Alendronic acid，ALN）组：在Pred组用药的同时，皮下注射ALN（3 mg/kg）周一到周五，每日1次。

1.2.3 血清骨代谢指标检测：造模完成后，在血清分离管中采集10 mL的血液，在室温下用800×g离心10 min，在血清分离成功后1 h内应用全自动生化分析仪测定血清钙、磷浓度，抗酒石酸磷酸酶（tartrate-resistant phosp-hatase，TRAP）和碱性磷酸酶（alkaline phosp-hatase，ALP）活性。

1.2.4 Micro-CT测定骨结构和BMD：1个月后处死大鼠，取其第1～第5节腰椎。将大鼠第5节腰椎以3.7%中性甲醛溶液浸泡固定过夜，再浸入70%乙醇中固定24 h。用Micro-CT扫描，扫描部位为第5腰椎上下生长板之间。所用能量为70 keV，密度为85 μA。扫描213张图（灰阶图），评估分析，以计算其骨小梁结构与厚度，并以Image Processing Language软件处理模拟出3D结构图。BMD以骨小梁体积（trabecular bone volume，TBV）、骨总体积（total bone volume，TBV）、骨体积分数（trabecular bone volume/total bone volume，TBV/TBV）、骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Th）、骨表面积和组织体积的比值（bone surface/tissue volume，BS/TV）、骨小梁数量（trabeculae number，Tb.N）、骨小梁分离度（trabeculae separation，Tb.Sp）、结构模型指数（structural model index，SMI）表示。

1.3 统计学处理方法 采用SPSS13.0统计软件分析。计量资料以 ±s表示，多组比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血清骨代谢指标检测结果 与对照组比，Pred组血清钙、磷水平显著升高，血清ALP活性和TRAP活性升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）。与Pred组比较，Pred+ALN组和Pred+β-Ecd（10 mg/kg）组血清钙、磷水平明显降低，ALP和TRAP活性也显著降低（P＜0.05）；Pred+β-Ecd（5 mg/kg）组，血清ALP和TRAP活性减低（P＜0.05），而钙、磷水平差异无统计学意义（P＞0.05）。见图1。

2.2 骨结构和BMD Micro-CT检测结果 在所有Pred处理组大鼠中均观察到不同程度的骨丢失。在Pred组中第5腰椎的BMD值明显低于对照组（P＜0.05）。Micro-CT评估显示Pred组BS/TV较对照组显著降低。三维模型分析显示，Pred组Tb.N、BV/TV均明显低于对照组，Tb.Sp明显增加（P＜0.05），但Tb.Th和SMI差异无统计学意义（P＞0.05）。与Pred组比，Pred+ALN组和Pred+β-Ecd（10 mg/kg）组BMD、BS/TV、BV/TV和Tb.N水平显著增加，而Tb.Sp和SMI降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）。与Pred组比，Pred+β-Ecd（5 mg/kg）组BMD、BS/TV、BV/TV和Tb.N水平显著增高，而Tb.Th和Tb.Sp水平降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表1和图2。

图1 各组大鼠血清生化指标比较

表1 各组大鼠第5腰椎BMD及微结构参数比较（每组n=6， ±s）

图2 各组大鼠第5腰椎CT三维重建图像

3 讨论

骨质疏松症的主要诊断评价标准包括BMD的测定和骨代谢生化指标检测[6]。生物化学和生物力学研究表明，Pred诱导干预的大鼠BMD下降和骨小梁结构退化[7]。此外，ALP、TRAP、钙、磷水平等生化指标的升高，提示骨吸收加重，成骨细胞活性下降，新生骨形成减少。近年来Pred诱导的骨质疏松模型已成功用于许多关于糖皮质激素性骨质疏松症的实验研究。研究[8-9]报道，Pred处理可降低骨矿物含量、皮质厚度、应力/应变指数和组织BMD。在本研究中，我们成功建立了Pred诱导的骨质疏松大鼠模型。

在血清骨代谢指标检测结果中我们发现Pred使血清钙、磷水平显著升高，并提高了血清ALP活性和TRAP活性，证实Pred诱导干预后大鼠的骨吸收加重，成骨细胞活性下降，结果与相关研究报道相符[7]，也进一步表明本研究中大鼠实验模型造模成功。但值得注意的是，在不同剂量的β-Ecd干预治疗后，不仅均可抑制ALP和TRAP活性，且作用程度随着剂量增加而增强。另一方面，随着剂量的增加可显著降低血清钙、磷水平，提示骨吸收降低。

腰椎是BMD及微结构参数常用检测部位[10]，研究表明，骨小梁结构是影响腰椎强度的关键因素[11]。动物解剖研究发现大鼠共6个椎体，其中第5、第6腰椎承受压力最大，但第6腰椎因难以取材完整，故在BMD及微结构参数的实验研究中一般都选择第5腰椎来观察。目前研究结果表明，BS/TV、BV/TV、Tb.N和Tb.Sp可能是早期检测骨小梁结构改变的敏感变量，用于早期检测骨小梁结构的改变，可预示骨质疏松症的发展。也有研究报道BMD与微结构参数相关[12]。本研究通过对大鼠第5腰椎进行Micro-CT检测发现，在所有Pred处理的大鼠中均观察到不同程度的骨丢失。BMD、BS/TV、Tb.N、BV/TV均明显降低，且Tb.Sp增加显著。但是通过不同剂量β-Ecd进行干预治疗后，能显著逆转增加BMD、BS/TV、BV/TV和Tb.N水平，与ALN作用结果相似。进而提示，β-Ecd可使骨质疏松性大鼠骨转换率和BMD增高。

综上所述，结合本研究结果表明，β-Ecd可能通过抑制骨丢失、改善骨代谢的作用机制，防治糖皮质激素性骨质疏松症。但本研究也存在不足之处，本研究结果仅为动物整体实验数据，尚缺乏体外分子实验。接下来本课题组将从骨组织细胞的活性分化及自噬、凋亡的角度，对糖皮质激素性骨质疏松的分子生物学机制及β-Ecd的干预作用进行更进一步的研究。