膜微粒抑制缺氧无血清诱导的骨髓间充质干细胞的凋亡

金培峰，姜盛，翁家侃，2，王磊，丁露，赵凯翔，孙成超

（1.温州医科大学附属第一医院 心胸外科，浙江 温州 325015；2.浙江大学医学院附属邵逸夫医院 心胸外科，浙江 杭州 310000；3.温州医科大学 机能中心，浙江 温州 325035）

研究表明在心肌梗死（myocardial infarction，MI）后移植骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）能够有效改善心功能[1-2]。由于MI部位的缺血缺氧，在细胞移植后的24 h后BMSCs的凋亡率达到了37.3%，使细胞移植的治疗效果受到严重影响[1]，虽然通过基因转染、添加生物因子能提高BMSCs的抗凋亡能力[3]，但存在潜在的致癌、细胞毒性的等缺点。因此寻找一种安全有效的提高BMSCs抗凋亡能力的方法，成为亟需解决的问题。

细胞膜微粒（microparticles，MPs）是细胞在激活或凋亡过程中从细胞膜上释放的直径0.1～1.0 μm的膜包裹的小囊泡，包含着原来细胞中所含的多种信号分子、膜脂类、细胞因子、miRNA、DNA、RNA、蛋白质等物质，有广泛的生物学功能[4]。如血液循环中的血小板MPs、内皮细胞MPs，淋巴细胞MPs等在促进血管新生、内皮祖细胞的分化、抑制靶细胞的凋亡中起着非常重要的作用[5]。本研究利用MI后血液循环中的MPs来预处理BMSCs，提高BMSCs的抗凋亡能力，从而改善BMSCs移植治疗MI的效果。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：32只雌性SD大鼠（体质量200～220 g）用来制作MI模型；3只雄性SD大鼠（体质量60～80 g）用来培养BMSCs。实验动物均由温州医科大学动物实验中心提供，动物使用批准号为SCXK（浙）2015-0001。

1.1.2 主要试剂：IMDM培养基（美国Gibco公司），胎牛血清（美国Gibco公司），AnnexinV/PI凋亡流式试剂盒（美国BD公司），胰酶（美国Sigma公司），厌氧产气袋（日本三菱公司），AZD5363（上海碧云天公司），Evans blue（美国Sigma公司），Hoechst33258试剂盒（美国BD公司），Tunel检测试剂盒（美国罗氏公司），PKH26（美国Sigma公司）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠MI模型制作：将雌性SD大鼠在水合氯醛麻醉下和小型动物呼吸机辅助通气下，左进胸结扎左冠状动脉前降支，制作大鼠MI模型[6]。

1.2.2 MI后血液MPs的提取和定量：在大鼠的MI模型建立后的24 h用水合氯醛对大鼠腹腔进行注射麻醉后进行全身肝素化。常规消毒铺巾后，打开腹腔后于腹主动脉取血，将采集到的血液在4 ℃的条件下，分别经过不同转速的梯度离心法去除血细胞、血小板、血浆，从而获取血液中的MPs，最后将MPs用PBS重悬后分装，并用于后续的实验[7]。为明确MI的面积，在大鼠处死后取出心脏，并用Evans blue生物染色剂对心脏进行灌注染色。为明确所获取的血液中MPs的浓度并用于后续的实验，将获得的MPs使用BCA法来测定蛋白浓度，得出其浓度为（2.00±0.23）μg/mL，并将各个样本的蛋白浓度统一调整至2 μg/mL用于后续的实验。

1.2.3 BMSCs的培养：体质量60～80 g的大鼠处死后在无菌条件下分离大鼠的股骨和胫骨，以全骨髓贴壁法分离并培养BMSCs[8]，每间隔48 h换一次含10% FBS的IMDM培养基，当细胞密度达到80%～90%融合时，按照1∶2的比例传代培养，取生长状态良好的第3代BMSCs用于本实验研究。

1.2.4 BMSCs对MPs的摄取作用：将获取的MPs用PKH26进行染色后，添加到生长良好的第3代BMSCs的细胞爬片中共培养8 h，再将细胞爬片固定后，用DAPI对细胞核复染，在激光共聚焦显微镜下观察。

1.2.5 细胞凋亡模型的建立和MPs的预处理：当第3代细胞生长达到70%～80%融合时用PBS冲洗2次，加入无血清的IMDM培养基及缺氧处理（置于密闭缺氧罐中，内置耗氧剂），置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱内培养6 h。其中正常组（Control组）为完全培养基（IMDM+10% FBS）正常培养；BMSCs在进行缺氧无血清处理前不添加MPs的为阳性对照组（Hypoxia/SD组）；将获取MI后血液来源的MPs（浓度为2 μg/mL）来对BMSCs进行预处理12 h，后再进行缺氧无血清处理6 h作为MPs组，再利用Annexin V-FITC/PI染色进行流式细胞仪检测。另外为明确不同浓度下的MPs对Hypoxia/SD条件下BMSCs的抗凋亡效果，分别按照正常浓度（2 μg/mL MPs组）、中等浓度（1 μg/mL MPs组）和低浓度（0.5 μg/mL MPs组）对BMSCs进行预处理后再进行Hypoxia/SD条件下的凋亡处理，并再利用Annexin V-FITC/PI染色进行流式细胞仪检测。

1.2.6 凋亡细胞的形态学检测、Tunel和Westernblot检测：将进行缺氧和无血清处理后的细胞用PBS洗1次，然后加入含Hoechst33342的无血清DMEM培养基，Hoechst33342终浓度为0.1 g/L，室温避光反应10 min。用相差显微镜和荧光显微镜观察，紫外光激发，观察凋亡细胞并拍片。在凋亡细胞的

Tunel检测中，将凋亡处理的BMSCs固定后，加50 μL Tunel反应混合液，充分反应后，再用DAB显色液进行显色。最后按常规方法进行苏木精复染，盐酸乙醇分化，自来水蓝化，系列乙醇脱水，二甲苯透明，封片，显微镜下观察。收集各组经过凋亡处理的细胞，提取蛋白后，用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，并按20 μg每孔上样，SDS-PAGE电泳，随后将分离的蛋白转膜至PVDF膜上，并经过5%脱脂牛奶室温封闭，分别经过一抗和二抗的孵育，再次洗膜，ECL发光，胶片显影、定影，每个样本重复3次。用Quantity one软件分析条带灰度值，以目的蛋白caspase-3和cleaved-caspase-3的灰度值和内参β-actin的灰度值的比值代表其相对含量。相对灰度值=cleaved-caspase-3/caspase-3，表示cleavedcaspase-3相对含量高低，反应凋亡情况。

1.2.7 细胞凋亡的相关信号通路检测：为明确MPs抑制缺氧无血清诱导的BMSCs凋亡的机制，在信号通路研究中，在MPs预处理前1 h添加1.5 μL AKT信号通路阻断剂AZD5363，经过缺氧无血清凋亡处理后收集各组细胞，用Annexin V-FITC/PI染色进行流式细胞仪检测。

1.3 统计学处理方法 采用SPSS16.0统计软件对数据进行统计学分析。计量资料用 ±s表示，2组间比较用t检验，多组间比较用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MI面积确定 左室前壁由于前降支的梗阻染色阴性，其MI面积为（37.63±2.06）%，达到本研究要求。

图1 蓝色未着色区域为梗死区域（Evans Blue染色）

2.2 BMSCs对MPs的摄取结果 在对BMSCs和MPs进行共培养8 h后利用激光共聚焦显微镜观察可见细胞质内充满了点状的红染的MPs，见图2。

图2 BMSCs摄取经PKH26染色的MPs的激光共聚焦显微镜观察结果（×200）

2.3 MPs对低氧无血清诱导BMSCs的凋亡抑制结果 BMSCs在经过缺氧无血清诱导6 h后发生了细胞凋亡，其主要表现为细胞核的固缩、染色质浓集、细胞变小；MPs能够有效减少低氧无血清诱导BMSCs凋亡细胞的数量，差异有统计学意义（P＜0.01），见图3。与MPs组比，Hypoxia/SD组cleavedcaspase 3表达量明显增加，差异有统计学意义（P＜0.01），见图4。

2.4 AZD5363抑制MPs抗凋亡结果 与Hypoxia/SD组比，MPs能有效减少缺氧无血清环境诱导的凋亡，差异有统计学意义（P＜0.01）；与Hypoxia/SD组比，0.5 μg/mL MPs组也有显著的抗凋亡作用，差异有统计学意义（P＜0.05），MPs的抗干细胞凋亡作用具有浓度依赖性；AZD+2 μg/mL MPs组的凋亡率显著低于AZD组，差异有统计学意义（P＜0.01）。见图5。

3 讨论

MI后MI部位缺血缺氧的微环境是导致移植的BMSCs凋亡的主要原因，从而使BMSCs移植治疗MI的效果受到了很大的限制，因此如何安全而有效地抑制BMSCs在MI部位的凋亡，提高干细胞移植的治疗效率，成为急需解决的问题。MPs可以利用所包涵的miRNA、蛋白等物质介导信息传递，在组织修复、细胞信号传导等起着非常重要的作用[4]。MI后由于机体血流动力学和内环境的剧烈改变，机体产生的MPs会被释放入血，导致外周血液中MPs会大量增加[9]，而且研究表明血液中MPs所包含的miRNA，如miR-133a、miR-21等，在促进血管新生、内皮祖细胞的分化、抑制靶细胞的凋亡中起着非常重要的作用[10]。因此在本研究中，我们利用MI后的血液中的MPs的这一特性来对BMSCs进行处理，发现其能有效抑制缺氧无血清诱导的BMSCs的凋亡，并且其抗凋亡的作用呈现浓度的相关性，在生理状态浓度下，其抗凋亡效果最佳。

图3 分别利用相差显微镜、Hoechst33342和Tunel染色的方法来观测各组细胞的形态学变化及凋亡细胞的阳性率

图4 各组cleaved-caspase-3和caspase-3的表达及相对灰度值比较

图5 不同浓度MPs抑制低氧无血清诱导的BMSCs的凋亡和AZD抑制MPs作用的流式细胞仪检测结果及凋亡细胞比例统计

由于MPs可以自体来源，并且在MI后MPs的量能够显著地增加，很好地解决免疫排斥和来源问题，相对于已有的基因转染、添加生物因子来提高BMSCs生物学功能的方法可能存在的致癌、细胞毒性等缺点，MPs在生物安全性方面更加可靠。并且有研究表明MPs对于靶细胞的表观改变是稳定的[11-12]，因此MPs是能够成为提高BMSCs抗凋亡能力而改善移植治疗效率的理想因子。

Akt可以通过下游多种途径对靶蛋白进行磷酸化而发挥抗凋亡作用，其可以激活IκB激酶（IκKα），导致NF-κB的抑制剂IκB的降解，从而使NF-κB从细胞质中释放出来进行核转位，激活其靶基因而促进细胞的存活。而AZD5363作为Akt信号通路的抑制剂，能够有效抑制Akt的磷酸化，因此能阻断Akt抗凋亡的信号通路作用。在本研究中AZD+2 μg/mL MPs组的凋亡率显著低于单纯AZD5363预处理后的AZD组，表明MI后血液中的MPs能够有效抑制AZD5363的拮抗作用，表明MPs抑制BMSCs的凋亡作用可能主要通过激活Akt信号通路来实现的。

本研究表明MI后血液中提取的MPs能有效地抑制干细胞在缺氧无血清环境中的凋亡，为今后提高MI后移植BMSCs的治疗效果提供了新的思路。