絮状表皮癣菌的基础与临床研究进展

刘加 梁官钊 刘维达

(中国医学科学院北京协和医学院皮肤病研究所 中国医学真菌菌种保藏管理中心,南京 210042)

皮肤癣菌是临床最常见的病原真菌，包括表皮癣菌属、小孢子菌属及毛癣菌属，因其具有嗜角蛋白的特性，可引起人类头发、光滑皮肤及指趾甲的感染，全球发病率约为20%～25%[1]。尽管皮肤癣菌病不少见，但一方面因为皮肤癣菌多感染皮肤角质层及甲，部分人仅因为美观而非医疗问题就诊；另一方面则因为皮肤癣菌对常用抗真菌药敏感，耐药少见，因此目前有关皮肤癣菌的研究甚少[2]。表皮癣菌属中则只有絮状表皮癣菌引起人类致病，多感染皮肤及指趾甲，头发感染甚为少见，说明絮状表皮癣菌与红色毛癣菌、犬小孢子菌等具有不同的特征，但是目前相关研究少见。因经济条件的改善，卫生设施的完善，絮状表皮癣菌的流行分布、易感人群等特征较前已发生了变化。随着基因组学的研究，以前未被发现的基因缺陷或者突变与宿主易感性也有重要的相关性。因此有关絮状表皮癣菌的基础和临床研究已发生了较大的变化。

1 基础研究

1.1 分子生物学研究

对皮肤癣菌的鉴别和分析，传统的方法是基于菌落的形态学特征，絮状表皮癣菌的培养可在17 d内完成[3]。为了缩短检验的时间，提高检验的准确性，基于核苷酸序列的方法已用来鉴别皮肤癣菌[4,5]。刘昕等[6]对任意聚合酶链反应(AP-PCR)、巢式PCR、多引物聚合酶链式反应等鉴别皮肤癣菌的方法已进行系统综述，本文着重论述有关絮状表皮癣菌近几年来分子生物学鉴别的研究进展。

自Makimura等[7]于1999年提出用内转录间隔区(ITS)来鉴别皮肤癣菌以来，这种方法目前已被许多实验室所采用。但近年研究者提出ITS序列不能将部分在生态学及流行病学上有差异的菌区别开来，如须癣毛癣菌与趾间毛癣菌[8]，越来越多的研究者倾向依据ITS序列、菌株的形态学和生理学特性、亲人或动物等特性来综合判断[9]。Normand等[10]对292株临床来源的皮肤癣菌进行ITS2序列扩增，将所得序列与5大DNA数据库(NCBI、CBS、ISHAM、FunBold、UNITE)进行比对，发现几大数据库之间存在不一致的情况，比对结果差异性多存在于毛癣菌属，而表皮癣菌属和小孢子菌属比对一致性较高。也有研究者利用其他DNA标记如D1/D2、延长因子(TEF1)、β-tubulin(BT2)等来鉴别包括絮状表皮在内的皮肤癣菌，研究者们多认为单个基因不足以完全界定各菌种间的关系，需要综合多因素考虑[11]。

实时PCR(RT-PCR)方法具有污染风险小、不需后续处理等优点，Sherman[12]等设计了针对絮状表皮癣菌、犬小孢子菌、须癣毛癣菌、石膏样小孢子菌的引物和探针，提取临床样本如皮屑、甲屑、头发的真菌DNA后在同一体系中进行多重RT-PCR试验，并将结果与传统如镜检、培养等方法进行比较。发现多重RT-PCR比传统方法的检出率明显提高，反应可在4h内结束，一次实验便可以完成对44种临床样本的鉴定。Motamedi等[13]通过两种方法对比发现RT-PCR对皮肤来源样本的准确率要高于来源于甲的样本，存在一定的假阳性率和假阴性率，故认为RT-PCR方法在临床上尚不能完全取代传统的检验方法。

Ahmadi等[14]通过对钙调基因进行分析，发现絮状表皮癣菌和亲土的库克小孢子菌组成同一类群(自展值为100%)，说明了絮状表皮癣菌和小孢子菌属有密切的联系。Garcia等[15]通过扩增皮肤癣菌PRP8蛋白内含子序列成功地将絮状表皮癣菌、须癣毛癣菌、红色毛癣菌、犬小孢子菌、阿耶洛毛癣菌、奥杜盎小孢子菌等鉴别。同时通过对归巢内切酶(HE)区域及dS/dN比值的分析证实了絮状表皮癣菌和石膏样小孢子菌为同一个起源的可能性。

表面增强拉曼光谱(SERS)是一种高灵敏度和特异性的光谱学方法。目前已有研究者将此法应用于曲霉和酵母菌的研究[16]，Witkowska等[17]采用表面增强拉曼光谱联合主成分分析(SERS-PCA)的方法实现了对絮状表皮癣菌、犬小孢子菌、红色毛癣菌、须癣毛癣菌等皮肤癣菌的鉴别，总体准确率为98%。与MOLDI-TOF相比，SERS具有价格便宜，不受培养条件影响等优点，在临床上可能具有更大的应用前景。

1.2 致病机制

皮肤癣菌最重要的特征为产生蛋白酶分解角蛋白，其感染过程包括黏附、出芽、产生菌丝、侵袭等阶段。研究表明絮状表皮癣菌与红色毛癣菌等在头发作为诱导物的时候，絮状表皮癣菌分泌的蛋白酶活性要低于红色毛癣菌等引起毛发感染的皮肤癣菌，解释了为什么絮状表皮癣菌不引起头发感染的部分原因[18]。在底物不同的时候，皮肤癣菌也能产生磷脂酶磷脂酶、白明胶酶和弹性蛋白酶，这些都被证实与其致病性相关[19]。

由于缺乏可靠的皮肤癣菌感染模型，其具体致病机制到目前尚未研究透彻。固有免疫在皮肤癣菌感染中的作用已被证实，近年来研究者们主要探讨适应性免疫在真菌感染中的作用。细胞介导的免疫在临床痊愈和预防再感染均有重要作用，其中CD4+T淋巴细胞被认为是机体抵抗皮肤癣菌感染的最重要成分[20]。Heinen等[21]通过动物实验证实TCR介导的免疫是控制皮肤癣菌感染的关键。Th1和Th17在适应性免疫中起到了重要的作用，Th17主要作用为清除病原真菌，Th1在病原菌清除和下调Th17诱导的炎症反应中均起作用。Heinen等[20]认为Th17信号通路的激活和IL-17的合成也有可能是机体固有免疫的一部分。

虽然皮肤癣菌多引起浅表感染，但能够引发宿主复杂的免疫反应，炎症因子在致病过程中也起到了重要的作用，且其种类及量不同影响了患者的临床表现。体内外实验证实亲人性皮肤癣菌如絮状表皮癣菌、红色毛癣菌等主要诱导角质形成细胞分泌IL-6、IL-8、IL-1β等细胞因子，引起的炎症反应相对较轻。而亲动物性皮肤癣菌如犬小孢子菌等除了诱导角质形成细胞分泌上述细胞因子外，还能刺激IL-10、IL-2、IL-15、TGF-β等的产生，引起强烈的炎症反应[22]。

基质金属蛋白酶-9(MMP-9)在炎症介质的刺激下产生，在组织的修复中具有重要作用，Warner等[23]认为MMP-9可以作为急性炎症的一个分子标记。Kitisin等[24]研究了絮状表皮癣菌在感染人包皮成纤维细胞时，发现在MMP-9抑制剂SB-3CT存在的条件下MMP-9的分泌有所减少，包皮成纤维细胞的活性相应地有所改善，因此在一定程度上减少MMP-9的分泌可以保护组织细胞免受絮状表皮癣菌的感染。

对于人类而言，表皮屏障受损如皮肤划伤、甲改变、青春期皮脂腺未完全发育等，以及环境湿度的增加均是皮肤癣菌容易感染的因素[25]。糖尿病患者皮肤癣菌感染率为正常人感染的3倍，尤其以足癣和甲癣多见[9]。

1.3 基因组学研究

线粒体DNA在每个细胞内均有大量的拷贝，具有保守区和可变区，可以作为分子标记来以利于研究种群的结构及其多样性[26]。如前所述利用单个基因来进行系统进化分析容易出现差错，而线粒体基因组则可以避免这种偏移。Tambor等[26]报道了絮状表皮癣菌线粒体基因组序列(30.9kb)，并与红色毛癣菌、构巢曲霉、马尔尼菲篮状菌的线粒体基因组进行比对，发现絮状表皮癣菌和红色毛癣菌具有高度的相似性，所得结论与系统进化发育具有一致性。Wu等[27]进一步对絮状表皮癣菌、红色毛癣菌、须癣毛癣菌等皮肤癣菌的线粒体基因组进行比较分析，发现6种菌的线粒体基因组具有相同的排列顺序，通过系统进化发育分析发现皮肤癣菌的分化要晚于其他致病真菌，并进一步证明了皮肤癣菌内部在进化上具有紧密联系，但是线粒体基因组分析未能说明絮状表皮癣菌和其他皮肤癣菌在进化上的相互关系。

自20世纪90年代以来，越来越多的研究者发现皮肤癣菌感染具有一定的宿主遗传易感性[28]。Ferwerda等[29]发现患者CLEC7A基因的突变，能够影响与真菌β-葡聚糖结合的Dectin-1蛋白的生成，从而影响宿主对病原真菌的识别过程。Jaradat等[30]发现编码抗微生物肽β防御素-2的DEFB4基因拷贝数下降的时候，宿主对皮肤癣菌的敏感性增加；且皮肤癣菌病患者基因组中DEFB4拷贝数要显著低于健康对照组，血清hBD-2、IL-22水平要高于对照组，表明基因和细胞因子的相互作用在皮肤癣菌的感染中也起到了一定的作用。

宿主抗真菌免疫应答通路的突变如CARD9、STAT3等已有报道[31]。Vaezi等[32]总结了既往报道的由CARD9缺陷导致的真菌感染病例，对发病率、地域分布及突变类型进行分析，亚洲因人口众多，CARD9突变率要高于非洲及其他国家，CARD9突变类型可能也具有一定的地域性，所有60例突变患者中，皮肤癣菌感染者占37.3%，尚未见絮状表皮癣菌感染的报道。

2 临床研究

2.1 流行现状

皮肤癣菌病近年来有上升趋势，其发病率与气候、经济条件及性别年龄等均有很大的关系。Zhan等[1]报道近100年以来，皮肤癣菌的分布也发生了较大的变化，絮状表皮癣菌、许兰毛癣菌、奥杜盎氏小孢子菌、铁锈色小孢子菌发病率有所下降，目前多见于发展中国家。Zamani等[33]对伊朗德黑兰某真菌科2010至2014年间皮肤癣菌感染患者进行统计分析，结果表明絮状表皮癣菌发病率位列第一(31%)，红色毛癣菌(26.2%)和须癣毛癣菌(20.3%)次之。Nweze等[34]和Coulibaly等[35]对非洲皮肤癣菌病进行系统回顾，其发病率可高达95%，致病菌的分布有地域和感染部位的差异，总体而言絮状表皮癣菌在体癣中发病率最高达16%，而在甲癣中的发病率最高为9%。而在相对发达的希腊克里特岛和巴西，Didehdar等[36]和Heidrich等[37]报道絮状表皮癣菌的发病率分别为2.5%和1.5%，次于红色毛癣菌、须癣毛癣菌和犬小孢子菌的发病率。说明絮状表皮癣菌的感染与经济条件、卫生状况等关系密切。

2.2 治 疗

目前唑类和特比萘芬为治疗严重皮肤癣菌感染的常用药物。Badali等[38]对临床分离的57株毛癣菌和11株絮状表皮癣菌进行体外药敏试验，药物主要包括两性霉素B、伊曲康唑、伏立康唑、泊沙康唑、艾沙康唑、特比萘芬、阿尼芬净、卡泊芬净。结果表明对于絮状表皮癣菌，特比萘芬的MIC值最低(0.03mg/L)，除伏立康唑外，其余的药均有一定的抗菌作用。传统抗真菌药作用靶点有限，虽然皮肤癣菌耐药少见，但是随着真菌的代偿性应激反应，参与药物外排、细胞解毒的基因过表达、编码靶酶的基因突变等均可能引起药物耐受[39]。现已有研究作用于新的靶点的抗真菌药，如抑制乙醛酸循环、嘧啶合成、细胞色素P450途径、铁代谢等代谢通路，以及在表观遗传学水平抑制转录因子等[40]，但这些药物试验主要集中于隐球菌、曲霉、念珠菌等能引起系统感染的菌种，有关皮肤癣菌的临床试验较少。

VT-1161为一种新型的细胞色素P450依赖酶-14α-羊毛脂醇脱甲基酶(cyp51)抑制剂，当药物浓度<1 nmol/L时能够选择性作用于真菌的CYP51[41]。Garvey等[42]报道了VT-1161体外抗皮肤癣菌活性，其中在絮状表皮癣菌中VT-1161的MIC值(<0.016～0.03 μg/mL)要低于伊曲康唑(0.03～0.12 μg/mL)。且VT-1161半衰期较长，每周一次给药可以达到与每日给药一次相近的血浆及皮肤的药物浓度，被认为比伊曲康唑服用更加方便。

姜黄素不仅是一种安全可食用的香料，其作为一种光敏性物质在抗菌方面的作用也逐渐被发掘[43]。Brasch等[44]在体外观察光动力联合姜黄素对皮肤癣菌包括絮状表皮癣菌生长的影响。结果表明絮状表皮癣菌对姜黄素最敏感，仅用0.2 μg/mL的姜黄素即可检测到明显的抑制作用，对其余皮肤癣菌如红色毛癣菌、须癣毛癣菌、犬小孢子菌等的抑制浓度为0.6 μg/mL，但其抑制机制目前尚未阐明。

外用抗真菌药难以渗透甲板，因此甲癣治疗较体癣、股癣要困难，复发率高，往往需要联合口服药物才能达到治疗效果。NO具有扩张血管、传递神经信号、促进伤口愈合等作用，NO在抵抗病原微生物的先天性免疫中也起到了一定的作用[45]。NVN1000为一种可以稳定提供治疗剂量NO的聚硅氧烷分子。Stasko等[46]研究发现絮状表皮癣菌、红色毛癣菌、须癣毛癣菌对NVN1000敏感，在2mg/mL的NVN1000(302 μg/mL NO)的作用下，4 h后99.9%的真菌被抑制。NO及其相关气体能够快速通过甲板和微生物脂膜，为临床高效地局部治疗甲真菌病提供了一种有效地方法。

Zhang等[47]经体外试验发现特比萘芬或联苯苄唑联合他克莫司时在抑制絮状表皮癣菌时具有协同作用，但是在联合曲安奈德时则没有类似作用。此外也有研究者报道次级地衣化合物如地衣酸[48]、百香油[49]等对絮状表皮癣菌也有抑制作用。

3 小 结

随着经济条件的改善，皮肤癣菌的流行情况不断发生着变化，絮状表皮癣菌的发病率较前已有所下降，但是在发展中国家如非洲等发病率仍可高达95%，需引起我们的注意。随着分子生物学技术和基因组学的发展，现已有不少文献报道了新的检测分类方法及与宿主易感性相关的基因，为了解其致病机制和临床的诊治提供了重要的方向。人们对美观较前有更高的要求，而絮状表皮癣菌感染皮肤、甲等暴露部位，在一定程度上可给患者带来沉重的心理负担，需要我们临床医生更全面掌握相应的临床及基础知识以提供更精细、针对性的治疗。因皮肤癣菌治疗疗程长及药物的不良反应，患者易忽略或放弃治疗，在一定程度上可能诱导耐药菌的形成，因此针对不同靶点的新药研发也具有重大意义。