2014～2018年北京协和医院酵母菌血流感染菌种分布和抗真菌药物敏感性分析

刘文静 孙宏莉 张小江 杨文航 肖盟 王瑶 杨启文 窦红涛 王贺 赵颖 郭莉娜 刘亚丽 张丽 朱任媛 徐英春

(中国医学科学院 北京协和医院检验科，北京 100730；北京市侵袭性真菌病机制研究与精准诊断重点实验室，北京 100730)

医学上重要的酵母菌包括子囊类酵母菌(念珠菌属、酵母属、芽裂殖菌属)和担子菌类酵母菌(隐球菌属、毛孢子菌属、红酵母属、掷孢酵母属、马拉色菌属、pseudozyma属)。念珠菌是住院患者侵袭性真菌感染的主要病原菌，在血流感染的病原菌中占第四位[1]。近十年念珠菌感染开始从白念珠菌向非白念珠菌，如近平滑念珠菌、光滑念珠菌和克柔念珠菌等转变[2]，对抗真菌药物的耐药性在逐渐增加。念珠菌血症病原体的分布和耐药性在不同地区存在明显差异[3]。因此，了解本地区念珠菌血症的菌种分布及耐药性对其诊治具有重要意义。除念珠菌外，其他酵母菌分离相对较少，本研究对北京协和医院酵母菌血症的病原菌分布及耐药性进行了分析如下。

1 材料与方法

1.1 材料

研究对象 北京协和医院2014年1月～2018年12月血培养分离出酵母菌同时临床诊断为酵母菌血症的患者共206例。

菌株来源 纳入药敏分析的酵母菌为来自患者血培养阳性的第一株菌，剔除了来源于同一患者的重复菌株。

仪器与试剂 BD BACTEC FX全自动血培养仪和配套血培养瓶(美国BD公司)， VITEK 2、MALDI-TOF MS、YSTID鉴定卡和ATB Fungus 3酵母样真菌药敏试验盒(法国生物梅里埃公司)，沙堡弱和科玛嘉显色平板(天津金章有限公司)，ABI3730XL测序仪(美国ABI公司)。

1.2 方法

菌种鉴定 所有送检的血培养标本均用全自动血培养仪进行需氧瓶、厌氧瓶和/或真菌瓶的增菌培养。需氧瓶或厌氧瓶仪器报阳后，将阳性标本转种于血琼脂平板、巧克力琼脂平板、中国蓝琼脂平板，同时涂片进行革兰染色进行显微镜检，若见到真菌孢子则加种沙堡弱和科玛嘉显色平板；若为真菌瓶报警阳性后，则直接将标本转种于以上5种琼脂平板，35 ℃温箱孵育24～48 h，肉眼观察菌落形态及颜色，进行初步鉴定。显色不典型的菌落用VITEK 2的API酵母菌鉴定卡 (YST鉴定卡)或MALDI-TOF MS进行菌种鉴定，两者均不能给出结果或菌名罕见的菌株则进行ITS测序。

药敏试验 严格按照ATB Fungus 3酵母样真菌药敏试验盒试剂说明书进行药敏试验，按照CLSIM59和CLSIM60对药敏结果判读，并进行统计分析。

2 结 果

2.1 血培养分离酵母菌菌种分布

血培养共分离非重复酵母菌206株。排在前3位的为白念珠菌72株(34.95%)、热带念珠菌42株(20.39%)和光滑念珠菌39株(18.93%)；少见菌包括季也蒙念珠菌、毕赤酵母菌、葡萄牙念珠菌、酿酒酵母、郎比可念珠菌、尼瓦利亚念珠菌、红酵母和希木龙念珠菌(见表1)。

表1 酵母菌血流感染各菌种分布情况

2.2 不同血培养瓶酵母菌阳性分离率、阳性报警时间及菌种分布

真菌瓶、需氧瓶和厌氧瓶酵母菌的阳性检出率分别为1.32%(79/6003)，0.43%(371/85855)和0.06%(47/77168)，真菌瓶的送检量逐年增加，但因需氧瓶和厌氧瓶总数多，需氧瓶和厌氧瓶酵母菌阳性菌株占所有血培养酵母菌阳性总数的构成比为84.10%(见表2)。需氧瓶、厌氧瓶和真菌瓶阳性报警时间分别为：(41.13±29.49)h、(49.46±24.22)h、(52.00±53.84)h。47份厌氧瓶酵母菌阳性标本中，光滑念珠菌占89.36%(42/47)，其他菌种分别为白念珠菌2株、热带念珠菌1株、季也蒙念珠菌1株、尼瓦利亚念珠菌1株。需氧瓶和真菌瓶酵母菌阳性标本中分离前2位的菌株均为白念珠菌和热带念珠菌，所占比率分别为66.31%和54.43%。

表2 血标本不同培养瓶酵母菌阳性检出率

2.3 几种主要酵母菌阳性报警时间

阳性报警时间从长到短依次为：光滑念珠菌(55.36±26.87)h，近平滑念珠菌(52.58±45.94)h，白念珠菌(49.17±35.37)h和热带念珠菌(23.38±19.32)h。

2.4 酵母菌血流感染患者年龄和性别分布

我院酵母菌血症发生于60岁以上的老年患者87例(42.23%)，男性115例(55.83%)，女性91例(44.17%)，详见表3。

表3 酵母菌血流感染患者年龄分布

2.5 酵母菌血流感染的科室分布

酵母菌血症前3位科室为急诊科41株(19.90%)，内科ICU和外科ICU均为36株(17.48%)(见图1)。

(续表)

图1 酵母菌血流感染的科室分布

2.6 ATB Fungus 3 MIC法药敏结果

白念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌和热带念珠菌对氟康唑敏感率分别为98.61%、97.44%、89.66%和71.43%。只有1株热带念珠菌对两性霉素B耐药。热带念珠菌和光滑念珠菌对伏立康唑的敏感性低于伊曲康唑，新生隐球菌对两性霉素B和伊曲康唑野生型(WT)菌株比率分别为81.82%和90.91%，其他药物WT菌株比率均为100%(见表4)。5-氟胞嘧啶药敏结果仅有2株克柔念珠菌、1株白念珠菌、1株光滑念珠菌和1株红酵母的MIC≥16 μg/mL，其余均≤4 μg/mL。几株少见酵母菌种体外药敏的分布(见表5)。郎比可念珠菌对氟康唑及红酵母对5-氟胞嘧啶的MIC高于ATB Fungus 3检测最高值。

3 讨 论

近年来随着抗真菌药物的使用及其他因素的影响，酵母菌的临床分布开始出现了从白念株菌向非白念株菌转变，不同的酵母菌的毒力不同，可以分为3组。第一组为白念珠菌和热带念珠菌，第二组为光滑念珠菌、葡萄牙念珠菌和酿酒酵母，第三组为克柔念珠菌、近平滑念珠菌和季也蒙念珠菌，3组念珠菌的毒力逐渐下降，念珠菌的毒力与其分布和耐药性相关[4]。本研究分离前3位的为白念珠菌、热带念珠菌和光滑念珠菌，可能与此理论高度相关。不同区域血流感染酵母菌分布不同，在中国、日本等亚洲国家以白念珠菌为主，巴基斯坦和印度则以热带念珠菌为主[5]，而在中国大陆少数地区则以非白念为主[6]。

表4 血流感染常见酵母菌对抗真菌药物的敏感性(S%，WT%)

*：流行病学折点，为WT(野生型)菌株的比率；“—”无判定折点

表5 少见酵母菌种体外药敏结果(μg/mL)

不同血培养系统检测念珠菌的敏感率为50%，厌氧瓶对念珠菌的检出能力较需氧瓶差，光滑念珠菌除外[7]，本研究厌氧瓶念珠菌阳性菌株中光滑念珠菌占89.36%。阳性报警时间为从血培养瓶放入血培养仪开始，至仪器出现阳性报警信号的时间。念珠菌阳性报警时间与标本中的菌浓度成正相关，与不同念珠菌具有不同的繁殖方式、繁殖周期等相关[8]，且与标本送检时间、血液中细胞等成分不同，是否使用抗菌药物等相关[7]。本研究阳性报警时间光滑念珠菌最长，热带念珠菌最短，白念珠菌与近平滑念珠菌居中，整体均值与国内相关调查结果基本一致[9]。使用抗真菌药物前，由于真菌瓶含有适于真菌生长的营养物质，阳性报警时间较需氧瓶和厌氧瓶短，且念珠菌阳性检出率比需氧瓶和厌氧瓶高。体外实验表明使用抗真菌药物后，各种血培养瓶的阳性报警时间均延长。使用不同的抗真菌药物念珠菌阳性检出不同[10]。本研究真菌瓶念珠菌的阳性检出率高于需氧瓶和厌氧瓶(分别为1.32%、0.43%、0.06%)，与文献描述一致。但需氧瓶、厌氧瓶和真菌瓶的阳性报警时间依次延长，可能与上述使用抗真菌药物等情况有关。

酵母菌血流感染患者主要在60岁以上老年人群且男性发病率高于女性，与文献报道一致[11]。研究指出老年人真菌血症的发生率高，抗真菌药物的使用比真菌易感基因更相关[1]。酵母菌血流感染主要分布于急诊科、内科ICU和外科ICU，与进行有创性操作、留置导管和和入住ICU等高危因素密切相关[11]。

氟康唑副作用相对少，费用相对低，是临床上酵母菌血流感染的首选药物。但对氟康唑天然耐药的克柔念珠菌、粘红酵母菌等，则要避免使用其进行治疗。本研究白念珠菌和近平滑念珠菌对氟康唑敏感率在90%以上，与CHIF-NET中国多中心近5年(2009-2014年)侵袭性念珠菌感染数据基本一致[12]；光滑念珠菌对氟康唑和伊曲康唑非敏感率(均为2.56%)，低于CHIF-NET和亚太地区数据6.8%～24.0%和3.9%～10%[12]。光滑念珠菌对伏立康唑的非野生型(NWT)菌株的比率为15.38%，在文献描述范围内(5%～17.8%)[5]。热带念珠菌对氟康唑(28.57%)和伏立康唑(26.19%)耐药率较高，且高于CHIF-NET数据21.0%和21.4%[12]，与亚太地区热带念珠菌对唑类的耐药率高一致，但欧美地区较低<10%。氟康唑耐药率增高与其广泛使用有关。治疗和预后分析发现光滑念珠菌、酿酒酵母氟康唑耐药菌株主要发生在7天抗真菌药预防性治疗(主要是氟康唑)的患者[3]。热带念珠菌和光滑念珠菌对唑类药物易产生交叉耐药，本研究伏立康唑的耐药率高于伊曲康唑，具体机制尚需进步研究，由于唑类药物的耐药率增高，棘白菌素类药物开始做为一线药物使用。抗真菌药物中两性霉素B是最敏感的药物，临床为了减少对患者的毒性反应增可加选用两性霉素B脂质体。5-氟胞嘧啶单药使用易产生耐药性，可联合其他抗菌药物治疗常见酵母菌所致全身感染。

酵母菌血流感染的准确及时诊断关乎患者的治疗及预后，需要使用合理的培养系统和检测方法，临床医生应根据药敏结果及时调整剂量或更改方案。