杜马斯燃烧法测定大豆水溶性蛋白含量的方法研究
2019-01-23王铁良魏亮亮刘冰杰周晓华
王铁良,魏亮亮,刘冰杰,郭 洁,贺 平，周晓华,魏 红,汪 红
(1.河南省农业科学院 农业质量标准与检测技术研究所，郑州 450002； 2.农业部农产品质量安全风险评估实验室(郑州)，郑州 450002； 3.河南省粮食质量安全与检测重点实验室，郑州 450002)
蛋白质是大豆重要的组成成分之一，大豆蛋白所含的必需氨基酸较为丰富，是植物性的完全蛋白，因其基因结构最接近人体氨基酸，所以是最具营养价值的植物蛋白，同时也是大豆重要的营养评价指标之一。水溶性蛋白是大豆蛋白的重要组成部分，约占大豆总蛋白含量的70%，主要由7S组分和11S组分组成[1]。大豆水溶性蛋白极易被人体吸收，具有良好的功能性质如凝胶性、乳化性、发泡性等，在大豆的加工利用中有着重要作用[2]。大豆水溶性蛋白含量(SPC)是评价大豆品质及衡量其价值的重要指标[3-5]，同时也是大豆是否适宜储存的重要判定指标[6-8]。因此，开展大豆水溶性蛋白的快速、准确分析方法研究具有重要的现实意义。
目前，大豆水溶性蛋白的测定方法主要有凯氏定氮法[9-11]、考马斯亮蓝法[12-13]及偶氮胭脂红G比色法[14-15]。凯氏定氮法是大豆水溶性蛋白检测现行有效的唯一标准方法[10-11]，也是目前研究机构和检验检测机构测定大豆水溶性蛋白的主要分析方法。然而，该方法试验过程烦琐，对操作人员要求较高，且试样消解过程会产生酸气、强碱溶液等对人体和环境有毒有害的“三废”物质，不太适合大批量试样的分析检验。考马斯亮蓝法和偶氮胭脂红G比色法试验消耗小、成本低，且灵敏度较高，适用于蛋白质含量较低的样品。然而，大豆水溶性蛋白含量较高，考马斯亮蓝法和偶氮胭脂红G比色法线性范围较窄，减小称样量或增加稀释倍数均会引入更大的不确定度，影响分析结果的精密度和准确度，不适合大批次大豆试样的水溶性蛋白分析工作。
本研究建立了一种杜马斯燃烧定氮法测定大豆水溶性蛋白的分析方法，通过优化大豆水溶性蛋白的提取方法和杜马斯燃烧定氮仪的仪器试验条件，快速、准确、无污染测定大豆中水溶性蛋白含量，以期为大豆水溶性蛋白的分析检验提供一种新的可行方法。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 原料与试剂
大豆-1、大豆-2、大豆-3、大豆-4、大豆-5(均由河南省农业科学院经济作物科学研究所提供)。
实验用超纯水(电阻率>18.2 MΩ·cm)，盐酸标准溶液(GBW
1.1.2 仪器与设备
DT-Dumatherm杜马斯燃烧定氮仪(德国Gerhard);2300全自动凯氏定氮仪(丹麦FOSS)；2040消化炉(丹麦FOSS)；Mettler-Toledo万分之一电子天平;EH20B电热板；JK-APG-50高速粉碎机;Cyclotec 1093旋风式样品磨(丹麦FOSS);HY-5数显调速多用振荡器;TG16-WS台式高速离心机；Milli-Q Syhthesis超纯水系统(美国密理博)。
1.2 试验方法
1.2.1 试样制备
大豆试样按四分法缩分，用高速粉碎机粉碎后过Φ0.25 mm网筛；或者直接使用安装了Φ0.25 mm网筛的旋风式样品磨粉碎大豆试样。
1.2.2 杜马斯燃烧定氮法测定大豆水溶性蛋白含量
称取大豆试样(1±0.1)g于50 mL离心管，加入30 mL(20±2)℃去离子水，振摇使试样不结块，均匀分散，然后控制温度在(20±2)℃恒温振荡40 min，3 500 r/min离心10 min，将上层水溶性蛋白提取溶液转移至100 mL容量瓶中；再加入30 mL去离子水，重复上述恒温振荡、离心试验操作1次，将提取液全部转移至100 mL容量瓶后定容、混匀。用快速滤纸过滤至100 mL烧杯中，弃去最初的5～10 mL的滤液。准确吸取滤液3～4 mL于锡箔杯中，置于150℃的电热板上加热蒸发、干燥，近干时加入硅藻土少许，吸附剩余水分，挤出锡箔杯中空气后放入杜马斯燃烧定氮仪样品盘中分析测定。
杜马斯仪器试验条件：氧化燃烧温度980℃，还原温度600℃，氧气流速300 mL/min,氧气因子1.4 mL/mg。
1.2.3 凯氏定氮法测定大豆水溶性蛋白含量
依据农业行业标准NY/T 1205—2006分析测定大豆试样水溶性蛋白含量。
2 结果与分析
2.1 凯氏定氮法分析结果
试样“大豆-1”水溶性蛋白含量测定结果为31.95%(n=5)，试验精密度(RSD)为0.9%。
2.2 杜马斯燃烧定氮法试验条件选择
2.2.1 不同固液比对水溶性蛋白提取率的影响
称取大豆试样1 g至50 mL离心管中，按1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50固液比，恒温振荡提取2次，每次提取40 min，离心后的上层水溶性蛋白提取溶液全部转移至100 mL容量瓶，定容、混匀。同时处理5个平行试样，用杜马斯燃烧定氮仪按1.2.2条件进行分析测定,结果见表1。
表1 不同固液比时大豆水溶性蛋白试验结果
由表1可以看出，不同的固液比对测定结果有明显影响。在提取过程中，大豆试样质量和水的比例在1∶10和1∶20时，试验精密度(RSD)差且大豆水溶性蛋白提取不充分；固液比在1∶30、1∶40和1∶50时，试验精密度(RSD)较好且大豆水溶性蛋白提取率在100%左右。
本研究在固液比1∶30、1∶40和1∶50时，准确度和精密度均较好的情况下，考虑到使用50 mL提取容器的操作便捷性，同时考虑到固液比在1∶30条件下提取溶液蛋白含量最低，引入测量不确定度最小，所以固液比采用1∶30。
2.2.2 不同提取次数和提取时间对大豆水溶性蛋白提取率的影响
称取大豆试样1 g，按照1∶30的固液比，采用1、2、3、4次不同的提取次数和20、40、60 min不同的提取时间处理试样，离心后的上层水溶性蛋白提取溶液全部转移至100 mL或200 mL容量瓶，定容，混匀，用杜马斯燃烧定氮仪分析测定，所有设计方案均处理5个平行。试验结果见表2。
表2 不同提取次数和提取时间时大豆水溶性蛋白试验结果
由表2可以看出,随着提取次数的增加和提取时间的延长大豆水溶性蛋白的提取率也随之增加。提取次数为1次时，提取时间20、40、60 min时的提取率分别为75.5%、86.8%、90.4%，提取率虽然逐渐提高，但60 min时仍未将目标成分提取完全；提取次数为2次时，提取时间20 min时的提取率达到92.7%，40 min时提取率已达到100.6%，即目标成分提取完全，60 min时提取率与40 min一致。提取时间为20 min时，提取至少3次才能达到完全提取的效果；而提取时间为40 min或60 min时，提取2次即可实现目标成分完全提取。
综合考虑工作效率、试验准确度和精密度，本研究选择试验条件为：提取次数2次，提取时间40 min。
2.2.3 提取液吸取量和干燥温度的选择
杜马斯燃烧法在分析过程中需要尽量去除水蒸气，否则会影响热传导检测器(TCD)的定量结果，所以对于试验试样要尽可能预干燥，使试样处于近干状态，更有利于分析检测。对于本研究，要解决大豆水溶性蛋白提取溶液如何实现蒸发、干燥达到适宜于杜马斯燃烧仪器分析的状态问题。
在大豆试样1 g、固液比1∶30、提取次数2次、提取时间40 min的试验条件下，分别吸取大豆水溶性蛋白提取溶液2、3、4 mL，与干燥温度120、150、180℃ 3个试验条件做交叉试验，将提取溶液预干燥至近干状态，所需时间见表3。
表3 不同提取液吸取量和不同干燥温度条件下所需时间
由表3可以看出，当提取液吸取量2 mL、干燥温度180℃时所需时间为20 min，耗时最短。但是考虑到称样质量、定容体积和大豆水溶性蛋白的含量范围等因素，对于水溶性蛋白含量较低的大豆试样，当提取溶液吸取量为2 mL时会因氮元素分析质量较小的缘故而影响试验结果的精密度和准确度，同时也会引入较大的不确定度。当干燥温度设定为180℃时，对于乳浊态提取溶液会存在爆沸现象，会有少量溶液溅出锡箔杯，使分析结果偏低。当干燥温度设定为120℃时，干燥时间过长，影响工作效率。综合考虑，本研究选择试验条件为：提取液吸取量3～4 mL，干燥温度150℃。
2.2.4 杜马斯燃烧定氮仪仪器条件的选择
杜马斯燃烧定氮仪仪器分析时需要根据不同的试样类型设置不同的氧气流速和氧气因子两个参数条件。以选定的大豆水溶性蛋白提取试验条件，设定氧气流速为200、300 mL/min和400 mL/min，与氧气因子1.0、1.2、1.4 mL/mg和1.6 mL/mg 4个设定条件做交叉试验，分析试样大豆-1水溶性蛋白的试验结果见表4。
表4 不同氧气流速和氧气因子下大豆水溶性蛋白分析结果(n=5)
由表4可见，氧气流速和氧气因子较低时，会导致大豆水溶性蛋白分析结果偏高，且试验精密度(RSD)较差。这可能是因为在氧气流速和氧气因子较低条件下，氧气供应不足，燃烧不充分，加上本试验样品与一般干基试样比较含水量较高，燃烧过程会有部分一氧化碳气体生成，而杜马斯燃烧定氮仪没有除去一氧化碳气体的设计，一氧化碳气体会和氮氧化物(NOX)的还原物氮气一起进入热传导检测器(TCD)。一氧化碳和氮气在0℃时的热导率系数分别为22.71×105g·J/(cm·℃·s)、23.78×105g·J/(cm·℃·s)[16]，非常接近，其与高纯氦气(He)热导率系数(140.64×105g·J/(cm·℃·s),0℃)[17]的差值也较接近，被检测器定量为氮气计算，最终导致大豆水溶性蛋白分析结果虚高。在氧气流速过高(400 mL/min)及氧气因子偏低(1.0 mL/mg)时，也会造成分析结果偏高，这可能是因为氧气流速较快时燃烧时间短引起的不充分燃烧所致。如果氧气流速和氧气因子设置过高时，超过燃烧化学计量数的氧气(O2)会消耗还原铜粉，造成仪器部件耗材的非正常消耗。交叉试验结果显示，仪器试验条件设定氧气流速为300 mL/min、氧气因子为1.2～1.6 mL/mg或氧气流速为400 mL/min、氧气因子为1.2～1.4 mL/mg时，试验结果精密度(RSD)较高、与凯氏定氮法一致性较好。
综合考虑，本研究选择试验条件为：氧气流速300 mL/min，氧气因子1.4 mL/mg。
2.3 本研究建立方法与凯氏定氮法的分析结果比较
以本研究建立的杜马斯燃烧法和凯氏定氮法分别测定5个大豆试样的水溶性蛋白含量，每个试样处理5个平行，试验结果见表5。
由表5可见，本研究建立的分析方法与凯氏定氮法的试验精密度(RSD)符合《实验室质量控制规范 食品理化检测》(GB/T 27404—2008)中“检测方法确认过程中实验室变异系数(CV)”的技术要求。由于杜马斯燃烧法仪器分析实际试样量较小的缘故，该方法的试验精密度略差于凯氏定氮法。对两种分析方法的测试结果进行t检验分析，统计分析表明，5个大豆样品的杜马斯燃烧法测试结果和凯氏定氮法测试结果之间无显著性差异(P=0.89)。
表5 本研究建立方法与凯氏定氮法的测试结果比较
2.4 讨论
由试验数据分析可以看出，本研究建立的杜马斯燃烧定氮法的测定结果比凯氏定氮法高0.8%～1.8%。这是由于两种方法分析原理及测定试样中的氮元素存在形态的范围不同所致。杜马斯燃烧定氮法是通过高温灼烧的方式将包括硝态氮在内的所有形态的氮元素参与燃烧、催化并定量检测，测定数值表征的是试样中的所有氮元素；而凯氏定氮法在试样消解过程中会有硝态氮逸失。所以最终试验结果前者略高于后者。
在我国现有的标准体系中，凯氏定氮法是大豆水溶性蛋白检测现行有效的唯一标准方法。近几年随着氮元素检测技术的不断发展、成熟，杜马斯燃烧定氮仪在国内检验检测和科研机构得到推广应用。而且该仪器在运行过程中不向环境释放有毒有害物质，属于环境友好型化学分析方法，是化学仪器分析未来的研究、发展趋势。
本研究建立的杜马斯燃烧法测定大豆水溶性蛋白的方法相对于目前的凯氏定氮法而言，因其商品化仪器设备标配自动进样器，以及其提取、蒸发、干燥、仪器分析等试验过程消耗时间短于凯氏定氮法提取、硫酸消解、仪器分析等所消耗的时间，所以本研究建立方法的工作效率和标准化程度优于现有的凯氏定氮法。虽然本研究创新性地引入蒸发、干燥程序，解决了杜马斯燃烧定氮仪只能进样硅藻土吸附后的0.1～0.5 mL液体试样的局限，使提取液体试样进样量达到3～4 mL，保证了试验结果的精密度和准确性，但鉴于水溶性蛋白提取溶液的特殊性，如若能设计、研发一种专用性的蒸发、干燥设备，将进一步提升该方法试验过程的自动化、标准化程度。
3 结 论
本研究建立了一种杜马斯燃烧定氮法测定大豆水溶性蛋白的分析方法，该方法的试验精密度符合GB/T 27404—2008中“检测方法确认过程中实验室变异系数(CV)”的技术要求，与现行采用凯氏定氮法方法标准的测定结果无显著性差异(P=0.89)。而且该方法属于环境友好型化学分析方法，可以满足大豆水溶性蛋白的无污染、快速、准确检测工作。
