狐狸源肺炎克雷伯氏菌分离株生物学特征分析

杨 延，刘 梦，赵丽丽，魏成威，王晓妍，蒋情琴，葛俊伟*，陈洪岩*

(1.东北农业大学 动物医学学院，黑龙江 哈尔滨 150030；2.中国农业科学院 哈尔滨兽医研究所，黑龙江 哈尔滨 150069)

肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pueumouiae)属肠杆菌科、克雷伯氏菌属，是一种重要的人兽共患病病原，目前已经成为仅次于大肠杆菌的第二大重要条件致病菌[1]。该菌可以引起肺炎、脑膜炎、肝脓肿、眼内炎、泌尿系统发炎，伤口感染和全身败血症等，发病率和死亡率极高。同时该菌的耐药性不断增强，且多为多重耐药，增加了临床治疗的难度。研究表明，人类是克雷伯氏菌感染传染源之一[2]，人源样本的检出率也在逐年上升，对人类的危害日益加剧，已经成为医院的重要潜在感染菌。长期以来，克雷伯氏菌并未对畜禽造成巨大危害，因此一直未引起足够重视。但近年来，不断有肺炎克雷伯氏菌感染动物的报道，目前已在发病兔、奶牛、猪、牛、雏鸡和大熊猫中分离出高致病性的肺炎克雷伯氏菌[3]。

已有报道发现肺炎克雷伯氏菌可以感染狐狸，引起狐狸上呼吸道黏膜充血、水肿，化脓性胸膜肺炎，母兽空怀、流产、死胎，个别有呕吐和腹泻症状[1]。但有关狐狸源肺炎克雷伯氏菌的研究多集中在病理报告和药敏试验，有关其耐药机制、致病性、生物被膜(Biofilm，BF)形成能力等方面的研究较少。本实验对从患病死亡的狐狸中分离得到的10株肺炎克雷伯氏菌致病性、耐药性、耐药机制、血清型和毒力基因进行分析，为今后研究该菌的致病机制、临床治疗和疾病防控提供了有效的实验依据。

1 材料与方法

1.1 病料样品及实验动物10株肺炎克雷伯氏菌(分别命名为：89F-2、58F-2、61N-1、克 1、61N-2、60N-1、克 2、87G-2、87N-2、81P-1)分离自 2015年～2017年期间黑龙江省不同地区狐狸养殖场送检至东北农业大学动物医院的病死狐狸。经溶血酶基因(khe)和16S rRNA基因检测确认为肺炎克雷伯氏菌菌株。55只6周龄～8周龄清洁级BALB/c小鼠购自哈尔滨医科大学实验动物中心。

1.2 主要试剂营养琼脂和革兰氏染色试剂购自青岛海博生物技术有限公司；细菌生化微量鉴定管和药敏纸片均购自杭州天和微生物试剂有限公司；细菌基因组提取试剂盒和质粒提取试剂盒均购自天根生化科技(北京)有限公司；柱式DNA胶回收试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司；DNA Marker、ExTaqDNA聚合酶和pMD19-T Simple试剂盒均购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.3 细菌分离培养及生化鉴定分离菌接种于血清LB培养基、伊红美蓝琼脂培养基、麦康凯培养基和血平板培养基，37℃培养24 h后涂片，进行黏液丝实验[4]和革兰氏染色镜检。同时依照伯杰氏手册及相关文献对分离株的纯培养物进行生化鉴定。挑取优势菌落到新鲜的LB液体培养基中，37℃培养过夜，加甘油冻存。

1.4 分离菌的小鼠致病性试验将55只小鼠随机分成11组，每组5只。分别将分离菌株纯培养物接种于血清LB液体培养基，37℃培养16 h，调整菌液浓度为1×109cfu/mL，小鼠腹腔注射 0.2 mL/只；对照组腹腔注射无菌血清LB培养液0.2 mL/只。观察2周内同一饲养状态下所有实验鼠的临床症状并对死亡小鼠各脏器进行细菌分离培养和鉴定。

1.5 分离菌的药敏试验及耐药基因检测根据WHO推荐的K-B纸片扩散法和美国临床实验室标准化协会(CLSI)手册，以E.coliATCC2592作为质控菌株，检测分离菌株对包括β-内酰胺类、氨基糖苷类、头孢菌素类、大环内酯类的21种常用抗菌药物的敏感性。同时，采用细菌质粒小提试剂盒提取分离菌中的质粒作为模板。参照文献[5-9]合成9对引物，分别用于扩增氟苯尼考耐药基因floR，介导恶唑烷酮类和截短侧耳素类药物耐药基因cfr，碳青霉烯类耐药基因NDM，质粒介导的黏菌素耐药基因mcr-1和超广谱β-内酰胺酶耐药基因TEM、SHV、CTX-M、CMY和OXA，分别对分离菌株进行上述耐药基因检测。引物由吉林省库美生物科技有限公司合成。

1.6 分离菌荚膜血清型及毒力基因检测 参照文献[10-11]，分别合成克雷伯氏菌5种毒力基因和最常见的2种荚膜血清型的引物。5个毒力基因包括：1个为质粒介导的毒力基因rmpA(黏液表型基因A的调控子)和4个染色体介导的毒力基因：wabG(与脂多糖合成有关)、ugE(与荚膜多糖合成相关)、fimH(Ⅰ型菌毛相关基因)和magA(粘液表型相关基因)。

1.7 分离菌的BF形成能力检测参照夏琦琦等[12]的研究方法，采用96孔微量板法，对分离菌株的BF形成能力进行检测。

2 结果

2.1 细菌分离及形态特征10株肺炎克雷伯氏菌在血清LB琼脂培养基上均可形成圆形、湿润、隆起、灰白色、粘液状的优势菌落；在伊红美兰琼脂培养基均形成中等大小、紫黑色带金属光泽的菌落；在麦康凯培养基上形成圆形、湿润具有扩散现象，粉红色特征不明显的中等大小菌落；在血琼脂平板培养基上所有菌株均不溶血，用细菌接种环向上挑起菌落，89F-2、58F-2、81P-1挑起黏液丝长度≥5mm，判定为高黏液表型菌；61N-1、克 1、61N-2、60N-1、克 2、87G-2、87N-2挑起黏液丝长度 ＜5mm，判定为非高黏液表型菌[4]。镜检结果表明，10株分离菌株均为革兰氏阴性，单个、成对或个别短链状排列的粗短杆菌，有荚膜，菌体大小为0.5 μm～0.8 μm×0.6 μm～2.0 μm。

生化鉴定结果显示，10株分离菌生化特征一致，均可以发酵多种糖类，不产生H2S，可分解尿素，利用枸橼酸盐等(表1)，与肺炎克雷伯氏菌的生化特征相一致，符合肺炎克雷伯氏菌的生物学特性。

表1 分离菌株的生化鉴定结果Table 1 Physiological and biochemical characteristics of the bacteria isolates

2.2 分离菌的致病性试验接种分离菌的实验组小鼠在感染6 h后发病，开始表现为站立不稳、精神沉郁、被毛逆立、腹式呼吸、眼睛紧闭，随后眼部伴有红色脓性渗出物和腹泻等症状，采食和饮水明显减少。接种24 h内50只实验组小鼠死亡47只。接种30 h后，仅存的3只实验组小鼠逐渐恢复，分别来自感染 58F-2、61N-2、89F-2菌液的实验组。对照组小鼠活动正常，未见异常。对死亡小鼠剖检，腹腔有土黄色胶冻状浑浊积液且易拉丝，肝、脾肿胀并伴有出血点，胃部胀气，淋巴结肿大。对死亡小鼠触片染色镜检，可见大量革兰氏阴性杆菌。进一步培养鉴定显示，死亡小鼠组织中分离得到的细菌与接种菌株的培养特性和染色特性一致。表明分离菌对小鼠具有较强的致病性。

2.3 分离菌的药敏试验KB扩散法结果显示，10株分离菌株大多数对多黏菌素(90%)、氟苯尼考(80%)和磷霉素(80%)高度敏感；对氨苄西林、青霉素钠、四环素、利福平、泰乐菌素、甲氧嘧啶、万古霉素、氯霉素、头孢噻呋钠、链霉素的耐药性较高，50%以上的菌株表现耐药(表2)。表明分离菌株具有很强的耐药性，且呈现多重耐药。

表2 分离株药敏试验结果Table 2 Susceptibility test results of the isolates

2.4 分离菌的耐药基因检测结果从分离菌提取质粒，对质粒进行鉴定结果显示，在10株肺炎克雷伯氏菌分离株中，7株菌(81P-1、87G-2、60N-1、克1、克 2、58F-2、89F-2)为 ESBLS阳性，且均检测到TEM基因，7株菌(81P-1、87G-2、61N-2、克1、克 2、58F-2、89F-2)检测到floR基因，4株菌(81P-1、87G-2、61N-2、克 1)检测到mcr-1基因 (图1)。所有菌株均未检测到CTX-M、CMY、SHV、OXA、cfr和NDM基因。

2.5 分离菌的荚膜血清型及毒力基因检测结果毒力基因检测结果显示，wabG和fimH检出率最高，为50%(5/10)，其次为uge，检出率为 40%(4/10)，rmpA检出率比较低，仅为10%(1/10)，magA未检出；同时检测到wabG、uge和fimH的有 4株菌(61N-1、61N-2、克 1、克 2)。血清型测定结果显示：89F-2、58F-2、60N-1的血清型为K1型，K2未检测到，表明分离的肺炎克雷伯氏菌株可能存在K1之外其它血清型，还有待于进一步确定。

图1 10株分离菌mcr-1基因的PCR结果Fig.1 Detection of mcr-1 gene in the isolates by PCR

2.6 分离菌的BF形成能力检测经96孔微量板测定，10株肺炎克雷伯氏菌中BF强阳性的有4株(克 1、克 2、87G-2、81P-1)，5 株(58F-2、61N-1、61N-2、60N-1、87N-2)呈现弱阳性，仅有 1株(89F-2)表现阴性，阳性率为90%。表明分离菌株具有较强的BF形成能力。

3 讨论

本实验对2015年～2017年黑龙江省多个养殖场送检的病死狐狸中分离的10株细菌形态特征、培养特性、生化试验进行检测，进一步确认其均为肺炎克雷伯氏菌。动物实验结果显示，分离株具有很强的致病性和致死率。毒力基因测定结果显示：wabG、fimH和uge检出率高(50%、50%、40%)，rmpA检出率低(10%)，magA未检出，本研究结果与杨帆等结果基本一致[13]。有研究表明fimH为I型菌毛的粘附蛋白，与肺炎克雷伯氏菌粘附上皮细胞相关；而wabG和uge主要作用为分泌细胞粘附式荚膜多糖，三者均是构成肺炎克雷伯氏菌高致病性的主要致病因子。本实验分离的狐狸源肺炎克雷伯氏菌中，61N-1、克 1、克 2和 61N-2等 4株菌(4/10)同时具有wabG、fimH和uge等 3种毒力基因，这可能是造成狐狸源肺炎克雷伯氏菌表现出强致病和致死率的因素之一。Brisse等的研究表明，几乎所有的肺炎克雷伯氏菌病的严重感染(肝外感染、血流感染、肝脓肿等)均与荚膜血清型菌株K1或K2相关，因此对10株肺炎克雷伯氏菌的血清型进行检测。结果显示3株菌检测到K1基因，K2基因未检测到。对未能确定荚膜血清型的7株高致死性肺炎克雷伯氏菌，对其荚膜血清型与致死性是否存在相关性将进行下一步的研究。

耐药基因检测结果显示，10株狐狸源肺炎克雷伯氏菌中有7株ESBLs为阳性菌，阳性检出率为70%(7/10)，且均为TEM型，未检测到SHV、CTX-M、CMY和OXA型。表明本研究中肺炎克雷伯氏菌产生的ESBLs耐药基因型以TEM为主，这与刀丽梅等报道的一致[14]。TEM是革兰氏阴性杆菌中最常见的β-内酰胺酶，主要介导细菌对各种青霉素和部分第1代头孢菌素耐药。这与药敏试验中分离的7株ESBLs肺炎克雷伯氏菌对氨苄西林和青霉素钠耐药率为100%的结果相一致。与此同时，对10株不同来源的狐狸源克雷伯氏菌进行mcr-1基因的检测，显示有 4株菌(分别为 81P-1、87G-2、61N-2、克 1)中携带mcr-1基因，这一现象在此前有关狐狸源克雷伯氏菌的研究中还未发现。值得注意的是，这4株mcr-1基因检测结果为阳性的肺炎克雷伯氏菌却均对多黏菌素敏感。这可能与质粒介导的耐药水平较低，K-B法测定耐药性所用的药敏片所含药量过大使得低水平的耐药无法显现。此前的研究表明，mcr-1基因介导的较低水平的黏菌素耐药，MIC值介于2 mg/L～16 mg/L，相比之前报道的染色体介导的黏菌素耐药水平低2～4倍[8]。这种现象出现的机制还需要进一步解析。

自2015年首次在猪肉、鸡肉和患者身上发现多黏菌素耐药基因mcr-1后[15]，已经有35个国家在人类、动物、食物和环境中检测到该耐药基因[8]。在我国，已经从鸡猪源大肠埃希氏菌[15]、猪源沙门氏菌、猫、犬源大肠埃希氏菌检测到mcr-1基因，同时在医院废水的肺炎克雷伯氏菌中也检验到mcr-1基因的存在。表明质粒介导的黏菌素耐药基因可能已经通过基因的水平转移至狐狸源克雷伯氏菌。使克雷伯氏菌对多黏菌素的耐药性更强，危害更大。同时因为该基因可位于多种质粒中，极易在细菌间水平传播，极大提高了多黏菌素耐药性迅速升高的可能性。因此，必须加强对畜禽的管理和人与动物中mcr-1基因的监测，严格规范这类药物的使用，防止因大量使用多黏菌素而造成肺炎克雷伯氏菌在畜禽甚至人群的暴发。对提取的10株分离菌的质粒中floR基因进行检测，结果显示共有7株菌(分别为 81P-1、 87G-2、 61N-2、 克 1、 克 2、 58F-2、89F-2)质粒中携带有floR基因并且这7株菌包括携带mcr-1基因的4株菌。这与易灵娴等研究结果中显示的mcr-1阳性菌株常携带其它耐药基因的结论相一致。同时，在分离的8株对氟苯尼考耐药的肺炎克雷伯氏菌中，7株含有floR基因，占87.5%，表明floR基因是导致氟苯尼考耐药的重要原因，其具体作用机制还需进一步研究。

药敏试验结果显示，分离的肺炎克雷伯氏菌对β-内酰胺类、头孢菌素、氨基糖苷类在内的多种常用抗生素具有较强的抗药性，而且存在严重的多重耐药现象。这可能与氨苄西林、青霉素钠、四环素、利福平等抗生素较为常见并且价格低廉，养殖户在狐狸养殖过程中对这些药物的滥用或不合理的使用有关。磷霉素、庆大霉素、多黏菌素、头孢哌酮在体外的抑菌效果最好，可以作为临床治疗肺炎克雷伯氏菌病的候选药物。Munoz-Price等研究表明，多黏菌素B和黏菌素对治疗多重耐药肺炎克雷伯氏菌引起的感染取得良好效果，并且用作饲料添加剂可以起到提高免疫力和促生长的作用，因此对于黏菌素的使用量正逐步增多。导致细菌对黏菌素的耐药性出现了上升的趋势，例如，对2006年～2007年韩国研究发现肺炎克雷伯氏菌对黏菌素的耐药率为6.8%[16]；2013年上海市某猪场调查发现大肠杆菌中57.4%的菌株对黏菌素表现耐药[17]。因而在临床治疗细菌性疾病时，也要注意粘菌素使用的剂量和交替使用，避免耐药菌株的产生。

本研究表明，从狐狸分离的致病性肺炎克雷伯氏菌的一个典型特征就是BF形成阳性率较高，而且均呈强阳性(+++)。从狐狸中分离的致病性肺炎克雷伯氏菌为何具有如此强的BF形成能力，又是否和致病性、耐药性有关系还需要进一步解析。