采用微量液基稀释法对伊可尔®抗菌剂体外抗真菌活性探索性研究

万喆 侯晴,2 李若瑜 王爱平

(1.北京大学第一医院皮肤性病科 北京大学真菌和真菌病研究中心，北京 100034；2.上海长征医院皮肤科，上海 200003)

伊可尔®抗菌剂是一种纯中药复方外用溶液，按照产品的说明书由苦参、金银花、大青叶、五倍子等为主要原料精制而成，其中乙醇含量为15%～25%，苦参含量为18 g/L，金银花含量为16 g/L，大青叶含量为16 g/L，五倍子含量为16 g/L。适用于皮肤抗菌，可杀灭金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白念珠菌。该中药复方外用溶液在体外是否具有抗真菌活性？抗真菌活性效果如何？是否能采用国际上公认的美国国家临床实验室标准化研究所 (Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)制订的M-38 A2 (皮肤癣菌)和M27-A3 (酵母菌)方案进行体外药敏试验？由于伊可尔®抗菌剂是一种复方中药外用溶液，含有一定量的乙醇溶液及沉淀物，因此，本研究先采用CLSI M-38 A2 (皮肤癣菌)和M27-A3 (酵母菌)微量液基稀释法对皮肤科最常见的红色毛癣菌及白念珠菌各1株菌进行了体外药物敏感性测定预试验，并对伊可尔®抗菌剂原液含乙醇与除乙醇进行比较，过滤与不过滤进行比较。根据预试验的结果，本研究对皮肤癣菌病中常见的两种致病菌即红色毛癣菌和趾间毛癣菌各10株菌进行了体外药敏试验，目的是采用微量液基稀释法对中药复方溶液体外抗真菌活性进行探索性研究。

1 材料与方法

1.1 受试药物

伊可尔®抗菌剂原液 (乙醇含量为15%～25%)及其除乙醇原液均由北京派特博恩 (天津)生物技术开发有限公司生产，许可证号 (津)卫消证字 (2017)第01号。规格：15 mL/瓶。伊可尔®抗菌剂测试样品见表1。根据预试验结果，最终采用了伊可尔®抗菌剂原液过滤 (乙醇含量为15%～25%)进行体外药敏试验。

表1 伊可尔®抗菌剂的测试样品

1.2 受试菌株

预试验菌株包括红色毛癣菌 (BMU-08583)1株和白念珠菌 (BMU-05260)1株。之后的受试菌株包括红色毛癣菌10株，趾间毛癣菌10株，均来自北京大学第一医院皮肤性病科、北京大学真菌和真菌病研究中心分离保藏菌株。

1.3 培养基

按照CLSI方案要求采用RPMI-1640液体培养基。

1.4 菌种培养和鉴定

预试验菌株和受试菌株均采用表型 (形态学)、生理生化及分子生物学的鉴定方法进行了鉴定。

1.5 体外药敏试验方法

红色毛癣菌和趾间毛癣菌参照CLSI M38-A2微量液基稀释法进行测定；白念珠菌参照CLSI M27-A3微量液基稀释法进行测定。

1.6 药敏板制作

将伊可尔®抗菌剂原液 (四种)1∶1稀释的药物作为第1孔浓度由高到低依次倍比稀释成10个药物浓度，即1∶1～1∶512；加入微量药敏板 (96孔酶标板)1～10列中，每孔100 μL，第11、12列分别加入100、200 μL相应液体培养基，分别作为生长对照和空白对照，-20℃保存备用。

1.7 菌液制备及接种

将红色毛癣菌和趾间毛癣菌菌株转种于PDA培养基上28℃培养生长5～7 d。用无菌生理盐水洗脱纯化的菌落，制成菌悬液，使用比浊仪调整菌悬液浓度至 (1～5)×106CFU/mL，再用RPMI-1640培养基稀释菌液50倍使其菌含量为 (2～10)×104CFU/mL。在96孔板中1～11列每孔加入菌液100 μL，使其最终菌浓度为 (1～5)×104CFU/mL。

将白念珠菌菌株转种于SDA上35℃培养生长24～72 h，制成菌悬液，使用比浊仪调整菌悬液浓度至 (1～5)×106CFU/mL，先用RPMI-1640培养基稀释菌液20倍，再稀释50倍使其菌含量为 (1～5)×103CFU/mL，在96孔板中1～11列每孔加入菌液100 μL，使其最终菌浓度为 (0.5～2.5)×103CFU/mL。

1.8 培养

红色毛癣菌和趾间毛癣置于35℃恒温培养，4～7 d看结果。白念珠菌置于35℃恒温培养24～72 h看结果。

1.9 结果判定

按照CLSI制定的标准进行结果判读。只有当生长对照生长良好，方认为试验成功，可进行结果判读。由于每次试验均设置对照，一般情况下的药敏试验每株菌进行一次检测。对于中药复方溶液进行体外药敏试验经验不足，本研究为确保试验准确性，每株菌同时进行了二次药敏试验，按照判断原则，只要二次测定结果在二个稀释度范围内，属于允许误差，表明两次测定一致性好，试验成功。

2 结 果

2.1 对红色毛癣菌和白念珠菌预试验

伊可尔®抗菌剂含乙醇原液 (过滤与未过滤)对白念珠菌的最小抑菌浓度 (MIC)均为1∶8；对红色毛癣菌的MIC分别为1∶64和1∶128。伊可尔®抗菌剂除乙醇原液 (过滤与未过滤)对白念珠菌的MIC均为1∶16；对红色毛癣菌的MIC均为1∶128。伊可尔®抗菌剂体外抗真菌活性预试验结果见表2。

表2伊可尔®抗菌剂体外抗真菌活性预试验结果

Tab.2Preliminary results of antifungal activityinvitrofor yikeer®antimicrobial agent

菌种 (株数)MIC伊可尔®抗菌剂含乙醇(过滤)伊可尔®抗菌剂除乙醇(过滤)伊可尔®抗菌剂含乙醇(原液)伊可尔®抗菌剂除乙醇(原液)白念珠菌 (1)1∶81∶161∶81∶16红色毛癣菌 (1)1∶641∶128 1∶128 1∶128

预试验结果提示伊可尔®抗菌剂具有一定的体外抗真菌活性，尤其对红色毛癣菌的作用更明显，MIC为1∶128 (即对伊可尔®抗菌剂原液倍比稀释8倍的结果)。对白念珠菌亦有抗菌活性，MIC为1∶8～1∶16 (即对伊可尔®抗菌剂原液倍比稀释4～5倍的结果)。结果显示含乙醇和不含乙醇溶液的伊可尔®抗菌剂对体外药敏试验结果基本无影响，说明乙醇无抗真菌活性，真正的抗真菌活性来自于伊可尔®抗菌剂中的中药成分。结果显示过滤和不过滤的伊可尔®抗菌剂原液对体外药敏试验结果亦无影响，说明真正的抗真菌活性亦来自于伊可尔®抗菌剂原液中的中药成分，但过滤后观察药敏板的菌落生长情况更加清晰。

2.2 对红色毛癣菌和趾间毛癣菌体外抗真菌活性

伊可尔®抗菌剂体外对红色毛癣菌的MIC在1∶64～1∶256；对趾间毛癣菌的MIC在1∶64～1∶128。每株菌两次试验测定结果一致性好。伊可尔®抗菌剂对红色毛癣菌和趾间毛癣菌体外抗真菌活性见表3。

表3伊可尔®抗菌剂对红色毛癣菌和趾间毛癣菌的体外抗真菌活性 (MIC)

Tab.3Antifungal activityinvitrotoT.rubrumandT.interdigitale(MIC) for yikeer®antimicrobial agent

菌种株数1∶321∶641∶1281∶2561∶512红色毛癣菌1004420趾间毛癣菌1007300合计20011720

3 讨 论

伊可尔®抗菌剂是一种纯中药复方外用溶液，系中科院采用超临界二氧化碳萃取技术精制而成。主要成分为鸦胆子、大青叶、苦参、蛇床子等，其中鸦胆子含有多种生物碱类、苦味素及油酸等，其药理作用是选择性破坏癌细胞膜和线粒体等膜性系统，使癌细胞发生退行性变或坏死，同时对感染的HPV合成复制具有抑制和清理作用。大青叶、苦参中含有大量的鞣质、醇类、皂甙等物质，具有强效的抗菌、抗病毒作用，可干扰、阻止HPV的DNA合成，抑制病毒生长与繁殖，同时具有清热解毒、活血散瘀、提高和激活皮肤免疫的作用[1-2]。

近年来，国内外对中药单体抗真菌作用有一些相关报道，卢详婷[3]对10种中药提取物抗念珠菌体外药敏试验结果显示三七总皂甙、人参茎叶皂甙、柠檬酸和麝香草酚对念珠菌具有一定的抗菌活性，不同的中药提取物针对念珠菌不同菌种的抗真菌作用存在一定差异。周艳萌等[4]采用结晶紫和XTT两种方法均测出厚朴煎煮液对白念珠菌黏附具有抑制作用，发现XTT法能更确切地检测厚朴煎煮液对白念珠菌的黏附抑制作用。但对于中药复方溶液抗真菌作用的研究罕见有报道。伊可尔®抗菌剂是一种中药复方溶液，目前主要用于HPV相关疾病的治疗，取得了良好的疗效。本研究显示伊可尔®抗菌剂对于红色毛癣菌和趾间毛癣菌体外具有明显的抗真菌活性，对于红色毛癣菌的MIC在1∶64～1∶256，即对伊可尔®抗菌剂原液倍比稀释到7～9倍具有抗真菌作用。对趾间毛癣菌的MIC在1∶64～1∶128，即对伊可尔®抗菌剂原液倍比稀释到7～8倍具有抗真菌作用。初步的研究显示伊可尔®抗菌剂作为一种中药复方溶液在体外具有一定的抗皮肤癣菌活性。采用CLSI M-38 A2微量液基稀释法对皮肤癣菌进行中药复方溶液体外抗真菌菌活性研究是可行的，具有实验结果易分析、方便、可重复性等优点。本研究仅对两个菌种各10株菌进行了探讨性体外药敏试验研究，有待于今后扩大样本数及扩充菌种进一步研究，为从中医中药中开发高效低毒的抗真菌药物提供理论和实验依据。