多位点序列分型技术在热带念珠菌中的应用研究

王影 项明洁 刘锦燕 叶书来 周馨

(1.中国科技大学附属第一医院检验科，合肥 230001；2.上海交通大学附属瑞金医院检验科，上海 200025；3.上海交通大学附属瑞金医院卢湾分院放免检验科，上海 200020)

念珠菌是一类条件致病性真菌，是目前临床上真菌感染的主要致病菌，常见的有白念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌和近平滑念珠菌等[1-2]。近年来，随着广谱抗生素和免疫抑制剂的使用，使得念珠菌的感染率日渐上升[3]。虽然在临床念珠菌的感染中白念珠菌最常见，但是由非白念珠菌类菌株引起的感染，其发病率和死亡率呈逐年上升趋势，其中以热带念珠菌较常见[4]。国内的一些研究显示，热带念珠菌分离率已成为非白念珠菌中第二位或者第三位[5-7]。

分子生物学技术已广泛应用于鉴定念珠菌基因型别以及菌株间致病相关性的研究，其中，基因分型是一种重要的微生物流行病学研究工具[8-9]，而MLST分型技术是目前公认的最有权威的分型方法。Arianna等[10]已在2005年建立了热带念珠菌MLST分型数据库 (https://pubmlst.org/ctropicalis/)。热带念珠菌MLST分型是基于对其6对管家基因的单核苷酸多态性 (single nucleotide polymorphisms，SNPs)的分析，这6对管家基因分别是ICL1,MDR1,SAPT2,SAPT4,XYR1和ZWF1a。通过基因PCR扩散、测序得到临床菌株各管家基因的序列，与数据库比对得到每个管家基因的等位基因号，再根据6个管家基因的基因号的组合得到每个菌株的二倍体序列型DST。目前，国内对热带念珠菌MLST型别的研究较少，此次研究旨在探究本地区临床菌株的优势MLST型别。

1 材料和方法

1.1 材料

菌株来源 本研究所用的的92株临床热带念珠菌均来自于上海市瑞金医院自2012～2015年的住院及门急诊的71名患者 (53名男性，18名女性)。其中，41株临床菌株来自于无菌体液 (中段尿30株、血液4株、胆汁2株、引流液2株、导管2株、穿刺液1株)，其余标本来自痰液33株、咽拭子4株、粪便7株、脓液1株、创面2株、肛周3株、分泌物1株。

仪器与试剂 API微生物鉴定系统 (法国梅里埃公司)；PCR仪 (S100TMThermal Cycler PCR，Bio-Rad美国)；Tanon EPS-300水平式电泳仪和Tanon凝胶成像系统 (上海天能科技有限公司)；YPD培养基 (上海博微生物科技有限公司)；Ex Taq酶 (TaKaRa公司)；DNA Marker DL2000 (TaKaRa公司)；MLST引物由生工生物工程 (上海)有限公司进行合成。

1.2 方法

菌株鉴定 将于-80℃ 25%甘油冻存的菌株标本接种于科玛嘉酵母菌显色平板，于35℃培养24～48 h后，热带念珠菌呈深蓝绿色。再用API 20C AUX酵母菌鉴定系统对临床分离的菌株进行进一步鉴定。将最终鉴定成功的菌落取单克隆增菌培养后，置于-80℃ 25%甘油培养液中冻存待用。

药敏鉴定 以白念珠菌ATCC 90028为阴性对照，克柔念珠菌ATCC 6258为阳性对照，采用微量肉汤稀释法检测菌株的最低抑菌浓度 (minimal inhibitory concentration，MIC)。具体检测方法按照美国临床实验室标准化协会 (the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)M27-A3方案进行。

DNA提取 热带念珠菌经YPD培养基35℃培养过夜，收集菌体，加酵母菌裂解液 (10%SDS、0.5 mmol/L pH 8.0 EDTA和蛋白酶K)后，65℃水浴2 h破壁，用苯酚、氯仿、异戊醇 (25∶24∶1)和氯仿各抽提1次，异丙醇沉淀，后用75%乙醇洗涤，加水溶解，-20℃冻存。

MLST基因分型检测 根据热带念珠菌MLST分型数据库 (https://pubmlst.org/ctropicalis/)及Arianna等的报道，选取热带念珠菌的6对管家基因，分别是ICL1,MDR1,SAPT2,SAPT4,XYR1和ZWF1a，根据数据库数据合成相应的引物序列，具体见表1。利用合成后的引物扩增临床菌株各管家基因片段，PCR反应体系包括Ex Taq酶0.25 μL，10×Ex buffer 5 μL (含20 mmol/L Mg2+)，dNTPs 4 μL，50 μmol/L的正向和反向引物各0.4 μL，DNA模板 (200 ng/μL)1 μL和双蒸水ddH2O 38.95 μL。PCR反应条件：94℃预变性2 min；94℃ 30 s,55℃ 30 s,72℃ 1 min,共29个循环；72℃延伸5 min。PCR扩增产物与6×loading buffer混匀后加入1.5%琼脂糖凝胶电泳孔，在Tanon EPS-300水平式电泳仪中电泳20 min，经Tanon凝胶成像系统证实为单一条带后，送生工生物工程 (上海)有限公司测序，测序引物与扩增引物相同，测序方法为sanger法，由于热带念珠菌为二倍体菌株，所有基因测序均采用正反双向引物同时测序。

表1 MLST扩增及测序引物

数据分析 利用Chromas 2.22软件处理热带念珠菌各管家基因测序结果。由于热带念珠菌是二倍体菌株，对于测序的杂合子位点，根据理论与应用化学国际联合会 (International Union of Pure and Applied Chemistry，IUPAC)的标准，C/T杂合、A/T杂合、G/T杂合、A/G杂合和C/G杂合分别用Y、W、K、R和S表示。整理后的测序结果与热带念珠菌MLST分型数据库 (https://pubmlst.org/ctropicalis/)比对，得到各菌株各管家基因的型号，将6个管家基因的型号组合即可得到每个菌株的MLST型号，将本研究中新得到的MLST型别上传至热带念珠菌MLST分型数据库。利用eBURST V3软件对临床热带念珠菌的系统进化关系进行分析。

系统发育树绘制 利用MEGA 6.0软件，基于菌株MLST型别采用非加权组平均法 (unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA)构建系统发育树，并对构建树进行自检 (Bootstrap)，重复次数设定为1 000次。

2 结 果

对临床92株热带念珠菌进行MLST分型，得到12种新的管家基因型别，47种DSTs型别。在47种DSTs型别中32种为新型，已将32种新型上传至热带念珠菌MLST数据库并得到审核。用eBURSTV3软件对临床热带念珠菌的系统进化关系进行分析，得到7个克隆簇，见图1，克隆簇1包含5种DSTs (503、504、341、346和519)、克隆簇2包含4种DSTs (507、505、506和376)、克隆簇3包含3种DSTs (516、526和525)、克隆簇4包含3种DSTs (337、522和149)、克隆簇5包含3种DSTs (331、443和394)、克隆簇6包含2种DSTs (520和514)、克隆簇7包含2种DSTs (333和532)。在47种DSTs中，有2种优势型别DST507和DST376，分别包含16株菌和11株临床菌株，占17.39%和11.96%，经eBURSTV3软件分析这两种DSTs属于同一种克隆簇。MEGA 6.0软件建立的系统发育树如图2所示，其建树结果与eBURSTV3分析结果稍有差异，但主要的克隆簇1和克隆簇2结果一致。

图1eBURSTV3软件分析结果：分为7个克隆簇和25个单个MLST型别

Fig.1The analysis result of eBURST V3:including 7 clonal clusters and 25 singletons

对基因型别为DST507和DST376的的27株临床菌株及其他6株属于单个MLST型别的菌株进行药敏检测，根据热带念珠菌对氟康唑，伊曲康唑和伏立康唑的耐药折点分别为≥8 mg/L, ≥1 mg/L及≥1 mg/L，结果显示6株属于单个MLST型别的菌株仅1株对至少一种药物耐药，耐药率为16.67%；而属于优势型别的27株临床菌株中有21株对至少一种药物耐药，耐药率为77.78%，其中有部分菌株来源于同一个患者，见表2。

图2 基于MLST型别的系统发育进化树

3 讨 论

热带念珠菌作为一种条件致病性真菌，正常情况下可定植于人体，如皮肤、呼吸系统、胃肠系统及泌尿系统等，但当患者免疫力低下时，可引起严重的系统性感染。研究表明，长期中性粒细胞减少症、恶性血液肿瘤以及接受骨髓移植是热带念珠菌感染的独立危险因素[4,6]，而由念珠菌引起的尿液或血流感染中，热带念珠菌占第一或者第二位[11]。由于抗真菌药物的广泛使用，热带念珠菌的耐药现象已成为临床治疗中的问题，Pfaller等[12]的研究称热带念珠菌对氟康唑和伏立康唑的耐药率高于白念珠菌。已有研究发现对棘白菌素类 (如卡泊芬净、米卡芬净和阿尼芬净)抗真菌药耐药的临床热带念珠菌[13-15]。与白念珠菌类似，热带念珠菌耐药机制主要表现为：菌株细胞膜上药物相关外排泵表达过度[16]，如CDR1、CDR2、MDR1及SNQ2；药物作用靶酶的改变，如ERG11、FKS基因突变[13,16]；生物膜的形成以及线粒体缺陷等[17]。

热带念珠菌的流行具有地域性区别，而亚洲地区是常见的流行高发区[17-18]。与白念珠菌相比，国内对热带念珠菌的研究相对较少，尤其是对其基因型别和流行病学的研究。本研究利用多位点序列分型技术对上海市瑞金医院92株临床热带念珠菌进行基因分型，分析得到7个克隆簇和2个优势型别DST507和DST376，有国外研究报道的优势型别为DST232，与国内不同[19]。本研究中得到的47个DSTs型别，32个为新型，占68.09%，说明临床上新型热带念珠菌出现频率很高，即管家基因单核苷酸变异率高。本研究中6株属于单个MLST型别的菌株耐药率为16.67%，而属于优势型别的27株临床菌株耐药率为77.78%，虽然菌株CR16、CR17，菌株CR18、CR19、CR21，菌株CR32、CR33分别来自于同一个患者P16、P17和P29，除去此因素，其耐药率仍为73.91%，这说明热带念珠菌基因型别可能与其耐药相关，已有研究表明热带念珠菌基因型别DST98、DST140和DST164与其药物耐药有关[20-22]，但也有研究认为这两者之间无相关性[19]。值得注意的是，属于优势型别DST507的16株菌株中，有5株耐药菌株来源于心脏外科或者心脏外科监护室，5株来源于急诊ICU，这提示我们这些临床分离菌株可能属于院内患者间互相感染，可能由耐药菌株不易控制及科室院感质控管理不当等原因导致。

综上所述，热带念珠菌作为一种临床上耐药率相对较高的常见条件致病菌，国内对其研究远低于白念珠菌，我们应在后续的研究中对其予以重视。MLST是一种分辨率高、客观且各实验室之间可比性高的基因分型技术，适用于菌株的流行病学调查研究，应在以后的研究中增加样本量，继续加强对国内热带念珠菌的流行病学研究。

表2 本研究部分菌株药物敏感性实验结果