白念珠菌细胞壁蛋白Csp37抗原表位预测

隋雪 姜远英 阎澜

(1.第二军医大学药学院新药研究中心，上海 200433；2.大连医科大学医学科学研究院，大连 116044)

白念珠菌是一种条件性致病真菌，与人体共生，然而，当人体变得虚弱易感，白念珠菌就会显现出强大的致病力，不但能引起宿主黏膜感染，如表皮损伤、肠道菌群失调，甚至能扩散入血，产生威胁生命的侵袭性感染[1-2]。其中，大多数受感染的宿主都是一些癌症患者、艾滋病患者、器官移植者、深部外科手术者和广谱抗生素过量使用者，以及其他先天或后天因素导致的免疫力低下者[3]。近年来，深部白念珠菌感染发病率逐年升高[4]。然而，治疗系统性真菌感染可选的治疗方案却很有限，药物主要有多烯类(如两性霉素B和制霉菌素)，三唑类(如氟康唑、伏立康唑)，丙烯胺类(如特比奈芬)，嘧啶类(如氟胞嘧啶)和棘白菌素类(如卡泊芬净)等[5]，菌株耐药性和药物毒性成为了临床治疗的潜在问题[6-7]。疫苗作为一种有效、毒副作用小的治疗手段将被众多研究者关注，基于疫苗免疫的预防和治疗方案也正成为抵抗白念珠菌感染的新策略。

细胞壁位于白念珠菌细胞的最外层，在真菌的生长繁殖、假菌丝的形成和与宿主的相互作用中发挥着重要作用，与此同时，真菌的细胞壁是病原体区别于宿主的独一无二的部分[8]，因此成为了抗真菌药物的理想靶标。Csp37蛋白是白念珠菌细胞壁蛋白，分子量为37kDa。Sentandreu M[9]等人研究发现，Csp37蛋白在白念珠菌菌丝生长和黏附中发挥着重要作用，在小鼠尾静脉注射0.5×106cells或者1×106cells或者1.5×106cells的CSP37基因缺失菌后，与野生型对照组相比，感染小鼠平均存活时间均有所延长，说明CSP37基因敲除能明显的降低白念珠菌毒力。本研究主要应用生物信息学方法，对白念珠菌细胞壁蛋白Csp37抗原表位进行预测和免疫原性分析，寻找B细胞表位和T细胞表位共有的序列区，探讨其作为抗白念珠菌感染疫苗靶点的潜能。

1 材料与方法

1.1 材料

从美国生物信息中心NCBI数据库 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下载白念珠菌SC5314的细胞壁蛋白Csp37的氨基酸序列，该序列为全基因组测序预测获得，Genebank登录号为KHC71123.1，具体序列见表1。

1.2 方法

本研究主要利用计算机软件和在线分析软件，具体信息见表2，对白念珠菌细胞壁蛋白Csp37进行抗原表位预测。采用ProtParam在线软件预测Csp37蛋白的分子量、等电点等理化性质。采用SignaIP 3.0和TMHMM在线软件分别预测Csp37蛋白的信号肽和跨膜区，用GOR4在线软件分析Csp37蛋白的二级结构。采用DNAStar软件中的Protean模块分析Csp37蛋白的氨基酸序列，根据Kyte-Doolittle方案预测其亲水性，Emini方案预测其表面可及性，Karplus-Schulz方案预测其柔韧性，Jameson-Wolf方案预测其抗原性指数，综合上述参数预测Csp37蛋白可能的B细胞抗原表位。采用ABCPred和Syfpeithi在线软件进一步分别预测Csp37蛋白B细胞和T细胞抗原表位。最后，综合分析B细胞和T细胞共有抗原表位。

表1 Csp37蛋白的氨基酸序列

表2 生物信息学软件

2 结 果

2.1 Csp37蛋白的基本理化性质

利用ProtParam网络服务器分析Csp37蛋白理化性质，显示该蛋白分子式为：C1635H2537N453O527S1，原子总数为5 153个，分子量为37.0 KD，理论等电点为6.57。在氨基酸组成上：Lys (K)有48个，占15.0%，含量最高；其次，Asp (D)有33个，占10.3%；负电荷残基 (Asp+Glu)总数为55，正电荷残基 (Arg+Lys)总数为54。不稳定系数为24.98，低于阈值40，预测该蛋白为稳定蛋白。脂肪系数为61.96，亲水性评估值为-1.147，依据分值越低亲水性越强，分值越高疏水性越强的规律，预测该蛋白为亲水性蛋白。

2.2 Csp37蛋白信号肽、跨膜区分析

通过SignaIP 3.0和TMHMM软件预测Csp37蛋白的氨基酸序列，发现该蛋白无信号肽、无跨膜区，初步分析该蛋白不是分泌型蛋白。

2.3 Csp37蛋白二级结构预测

使用GOR 4在线软件对Csp37蛋白进行二级结构预测，结果如图1，发现α-螺旋占15.8%；β-折叠占28.2%；无规则卷曲区域占54.0%，具体数据见表3。

2.4 Csp37蛋白的亲水性、蛋白表面可及性、柔韧性及抗原指数

预测的结果如图2所示，图中柔韧性为有线段标记区域；抗原指数、亲水性及表面可及性为各自横线以上部分，当亲水性>0，抗原指数>0，表面可及性>1时，形成表位的可能性大，具体数据见表4。

表3 GOR4分析的Csp37蛋白二级结构

表4 DNAStar软件预测Csp37蛋白的亲水性、蛋白表面可及性、可塑性及抗原指数

图1 GOR4分析的Csp37蛋白二级结构 图2 DNAStar软件预测Csp37蛋白的亲水性、蛋白表面可及性、可塑性及抗原指数

Fig.1Secondary structure of Csp37 using GOR4 analysis (Alpha helix (Hh), Extended strand (Ee), Random coil (Cc))Fig.2DNAStar prediction results of hydrophilicity, surface probability, flexible regions and antigenic index of Csp37

2.5 Csp37蛋白的B细胞抗原表位预测

使用在线预测软件ABCPred预测，每组表位的氨基酸残基数选择默认值16，得分阈值设置为默认值0.54，获得具体数据见表5。氨基酸序列的得分越高，越有可能成为B细胞表位。根据抗原表位的基本预测原则，即抗原指数高；亲水性、可塑性和表面可及性好；二级结构避免α螺旋和β折叠，优选 β转角和无规则线圈，得到9个较好的B细胞表位，具体区域为：19-24，45-48，76-78，100-105，153-158，179-184，222-225，249-252，303-305 aa。

2.6 Csp37蛋白的T细胞抗原表位预测

选择中国各民族中基因频率较高的HLA-DRB1*0301，利用在线软件Syfpeithi对Csp37蛋白的T细胞抗原表位亲和力进行预测[18]，结果显示评分大于等于18的序列，具体数据见表6。其中，评分较高 (≥25)的T细胞表位8个，具体区域为：97-111,303-317,257-271,299-313，221-235，281-295，137-151，235-249 aa。

2.7 Csp37蛋白的B细胞和T细胞抗原表位综合分析

综合B细胞与T细胞抗原表位的预测结果，分析比较，取各项参数比较相一致的序列，确定Csp37蛋白B细胞和T细胞共同表位5个，具体优势区域为：45-48，76-78，153-158，222-225，303-305 aa。

3 讨 论

随着抗肿瘤放化疗、介入治疗、器官移植术后免疫抑制剂的广泛应用，尤其是艾滋病的流行，免疫功能低下或缺陷的患者数量不断增加，侵袭性真菌感染已逐渐成为一种常见病、多发病，并已成为免疫功能低下人群死亡的主要原因。念珠菌是机会性致病真菌中的主要一属，其中白念珠菌的毒力最强，感染率最高，引起严重的侵袭性念珠菌病，死亡率高达40%。开发一种有效的毒副作用小的疫苗，对于抗白念珠菌感染的预防和治疗具有重要意义。

表5 ABCpred预测Csp37蛋白的B细胞表位

表6Syfpeithi预测Csp37蛋白的HLA-DRB1*0301限制性T细胞表位

Tab.6Prediction of HLA-DRB1*0301 restricted T cell epitopes of Csp37 using Syfpeithi

序号序列起始位点评分1EDAVDNDKNVFVVGI97281GDDVYNDFAKRFDDL303282AIKGVEDAKSNFEKL257272LKLFGDDVYNDFAKR299273YEQAKGDWNKALDDL221263KNQKLKDAQDHFGKS281 264SPNVEVKEKSIFGNW137254LSKQWNDSKKQLNGR235255VDQLKNDADKKINEA159225FEKLSNDLANDASKN268226KQVKNSDVYQKLQSN 74 216DKNVFVVGIQKYIDF 103 216SNDLANDASKNQKLK 272 216LENLKLFGDDVYNDF 296 216NLKLFGDDVYNDFAK 298 217KKADELDKKANEAIN190 208VQPILPRQQHQELAY 24 198QPILPRQQHQELAYQ 25 198VFVVGIQKYIDFVNQ 106 198GIQKYIDFVNQLGEG 110 198YSTVSPNVEVKEKSI 133 198NWFDKSDNKVDQLKN 150 198DHFGKSLENLKLFGD 290 199VENKGSELNNKLTKK 43 189TKKIEEGKKFVNEKT 55 189TESVTKQVKNSDVYQ 69 189NSDVYQKLQSNTEDY 78 189LQSNTEDYKKHVEDA 85 189IDFVNQLGEGKVQTG 115 189DNKVDQLKNDADKKI 156 189QLKNDADKKINEAKD 161 189NKALDDLSKQWNDSK 229 18

近年来，生物信息学广泛运用于蛋白质抗原表位的预测，不仅节约了科研时间、降低了科研经费，而且优化了实验设计。所谓抗原表位是指抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团，抗原可以借表位与相应抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合而发挥免疫效应。理想的抗原表位是兼有B细胞表位和T细胞表位的功能，其中T细胞仅能识别抗原递呈细胞加工处理的线性表位，B细胞则既可以识别线性表位又可以识别构象表位。正确预测表位和分析蛋白免疫原性将对疫苗和单克隆抗体的研发具有很大的帮助。

本研究运用多种生物信息学软件，综合分析预测了白念珠菌细胞壁蛋白Csp37的抗原表位。首先，了解了该蛋白为亲水性蛋白，无信号肽，非跨膜蛋白；其次，优选抗原指数高[19]，亲水性、柔韧性和表面可能性良好的序列[20]，以满足上述4种中3种条件的序列为初选表位序列，另外，由于α-螺旋、β-折叠的化学键能较高 ,不易形成抗原表位，所以应尽量避免，而优选β转角及无规卷曲等较松散的二级结构[20]；最后，将上述获得的候选表位序列与预测的B细胞表位序列相结合，在辅以预测T细胞表位序列，确定Csp37蛋白B细胞和T细胞共同表位优势区域。

本研究尽管初步预测了Csp37蛋白的抗原表位，但还是存在很多问题。由于B细胞表位大部分都是构象表位，因此，本研究想通过SWISS-MODEL在线软件对Csp37蛋白进行三维结构建模[21]，但结果发现Csp37蛋白序列与数据库中模板序列只有不到20%的一致性，获得的三维结构可信度较低，无法用来作为参考。此外，单参数预测某一蛋白质的抗原表位有一定的局限性，在满足基本的表位条件下，即至少3个连续氨基酸以上的序列，最好是6个以上的连续氨基酸，而且，应该采用多参数和多方法的综合预测，但在实施过程中一直没有绝对的标准，预测条件太严格可能得不到序列，预测标准降低又会降低表位预测的准确性和特异性，所以，预测会存在小部分的主观性,有一定的误差。最后，表位预测是一种经验性较强的学科，需要对比不同的分析软件，且对同一性质的预测不同软件基于的原理可能有所不同，进而应用不同方法对同一蛋白的表位预测可能会获得不完全一致的结果，因此，具体蛋白表位仍需要通过实验来进行进一步验证。

整体来说，通过表位预测进行抗白念珠菌感染疫苗或抗体的研究仍然较少，本研究利用生物信息学方法初步分别预测到了白念珠菌细胞壁蛋白Csp37的B 细胞表位9个和T细胞表位8个，以及共有的优势抗原表位5个，发现该蛋白含有丰富的抗原表位，具有诱导细胞免疫应答和体液免疫应答的潜能，可以据此设计并合成多肽，作为疫苗研究的新靶点。