3种方法检测艾滋病患者血和脑脊液中隐球菌的结果分析

曹宇硕 钱雪琴 蔡金凤 陈智瑾 赵洋洋 朱召芹 卢洪洲

(1.上海市公共卫生临床中心检验医学科；2.上海市公共卫生临床中心感染与免疫科，上海 201508)

艾滋病 (Acquired Immune Deficiency Syndrome, AIDS),又称为获得性免疫缺陷综合征,是因HIV 侵入机体,破坏CD4+淋巴细胞,引起细胞免疫严重缺陷，导致患者抵抗力降低，继发内源性及外源性感染、恶性肿瘤和神经系统病变为特征的临床综合征。AIDS患者合并感染常见真菌有荚膜组织胞浆菌、马尔尼菲篮状菌、念珠菌属、隐球菌属、耶氏肺孢子菌[1]。隐球菌的检测方法主要有真菌培养、墨汁染色、隐球菌抗原检测。我们回顾性分析了2017年1～12月本院收治的AIDS患者不同隐球菌检测方法的结果，以期筛选出诊断AIDS合并隐球菌感染较好的检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料

标本来源于2017年1～12月，本院收治并确诊的1 049例艾滋病患者的血液和脑脊液。

1.2 主要试剂

VITEK 2 YST酵母菌鉴定卡为法国梅里埃生物公司生产，成人中和抗生素培养瓶为美国Becton,Dickinson and Company公司生产，血平板和沙氏培养基购自上海科华微生物试剂有限公司，新生隐球菌抗原试剂盒为美国IMMY公司生产，墨汁染液为珠海贝索生物技术有限公司生产。

1.3 方法

真菌培养和鉴定：抽取脑脊液标本1～5 mL和全血标本5～10 mL,分别注入BD FX需氧培养瓶，待仪器报警显示阳性时，取出标本，用注射器吸取少量标本，分区划线接种于血琼脂平板和沙氏培养基，分别置于35℃和25℃孵育箱中培养12～24 h，用YST酵母菌生化鉴定卡对其进行菌种鉴定。刮取培养基上真菌菌落，用0.45% NaCL 3 mL调成1.8～2.2 McF真菌悬液，借助VITEK 2鉴定仪，将菌液注入YST鉴定卡的微量生化孔中，鉴定仪通过比色或比浊自动判读生化反应结果，鉴定是否为新生隐球菌。

墨汁染色:将收集的脑脊液高速离心，3 000 g离心10 min，弃上清，沉淀约以5∶1比例与墨汁混匀镜检，在黑色背景下见到出芽或不出芽、大小不均的菌体和透亮的宽厚荚膜为阳性。

侧向免疫层析法 (LFA)：常规方法收集脑脊液和全血样本，1 000 g离心15 min，样品无需预处理，于试管中滴入1滴标本稀释液，用微量加样器取40 μL的脑脊液或血清加入试管中，随后将隐球菌抗原检测试纸条的白端没入到混悬液，室温孵育10 min后进行结果判读。判读标准：对照区存在红色条带，检测区无红色条带表明检测结果为阴性；对照区存在红色条带，同时检测区也存在红色条带表明检测结果为阳性；对照区无红色条带存在，无论检测区有无红色条带均表明此次检测结果无效，应查找原因。

统计学方法:统计学分析采用SPSS 14.0统计软件包进行统计学分析，计数资料采用χ2检验，以P<0.05差异有统计意义。

2 结 果

2.1 脑脊液墨汁染色结果

328例AIDS患者脑脊液墨汁染色，59例阳性，阳性率为17.99%。

2.2 真菌培养结果

对688例AIDS患者血标本进行真菌培养，19例培养出新生隐球菌，阳性率为2.8%；对316例AIDS患者进行脑脊液真菌培养，29例培养为新生隐球菌，真菌培养阳性率为9.18%；其中189例患者的血和脑脊液标本均进行了真菌培养，17例患者血标本培养出新生隐球菌，阳性率为8.99%，脑脊液培养检出新生隐球菌22例，阳性率为11.64%。脑脊液真菌培养阳性率高于血培养，差异无统计学意义 (χ2=0.71，P>0.05)。血与脑脊液标本培养结果一致性具体见表1。

表1189例艾滋病患者血与脑脊液标本培养结果一致性比较

Tab.1Comparison of the results of blood and cerebrospinal fluid culture in 189 AIDS patients

血液培养脑脊液培养阳性阴性合计阳性14317阴性8164172合计22167189

2.3 脑脊液培养隐球菌检出率与墨汁染色结果一致性比较

313例患者同时做脑脊液墨汁染色和真菌培养，墨汁染色阳性57例，阳性率为18.21%；真菌培养阳性29例，阳性率为9.27%，脑脊液墨汁染色阳性率高于真菌培养阳性率，差异有统计学意义 (χ2=10.57，P<0.01)，两者一致性比较见表2。

表2313例艾滋病患者脑脊液培养与墨汁染色结果一致性比较

Tab.2Comparison of cerebrospinal fluid culture and ink staining results in 313 AIDS patients

脑脊液培养脑脊液墨汁染色阳性阴性合计阳性26329阴性31253284合计57256313

2.4 侧向免疫层析法检测结果

1 049例AIDS患者进行侧向免疫层析法检测，阳性115例，阳性率为10.96%，其中956例患者血标本侧向免疫层析法检测，阳性101例，阳性率为10.56%；294例患者脑脊液进行侧向免疫层析法检测，70例阳性，阳性率为23.81%；201例患者同时做脑脊液和血侧向免疫层析法检测，脑脊液阳性56例，阳性率为27.86%，血阳性75例，阳性率37.31%，血侧向免疫层析法检测阳性率高于脑脊液，差异有统计学意义 (χ2=4.09，P<0.05)。两种标本联合检测一项或两项阳性例数为76例，阳性率为37.81%。两者一致性见表3。

表3201例艾滋病患者脑脊液和血标本侧向免疫层析法检测结果一致性比较

Tab.3Comparison of the results of lateral immunochromatographic assay between cerebrospinal fluid and blood samples of 201 AIDS patients

脑脊液检测血标本检测阳性阴性合计阳性55156阴性20125145合计75126201

2.5 脑脊液墨汁染色与侧向免疫层析法检测结果比较

292例AIDS患者同时做脑脊液墨汁染色和侧向免疫层析法检测，墨汁染色阳性57例，阳性率19.52%，脑脊液侧向免疫层析法检测阳性70例，阳性率为23.97%，脑脊液侧向免疫层析法检测阳性率大于墨汁染色法，差异无统计学意义 (χ2=1.70，P>0.05)。联合检测一项或两项阳性例数为73例，阳性率为25%。详见表4。3例墨汁染色阳性，脑脊液侧向免疫层析法检测阴性者，有2例血清侧向免疫层析法检测阳性，滴度分别为1∶2 560和1∶80。

表4292例艾滋病患者脑脊液墨汁染色与侧向免疫层析法检测结果一致性比较

Tab.4Comparison of the results of cerebrospinal fluid ink staining and lateral immunochromatography in 292 AIDS patients

脑脊液墨汁染色脑脊液侧向免疫层析法检测阳性阴性合计阳性54357阴性16219235合计70222292

2.6 血真菌培养与侧向免疫层析法检测结果一致性

338例AIDS患者同时做血真菌培养和侧向免疫层析法检测，血真菌培养新生隐球菌阳性5例，阳性率为1.48%；侧向免疫层析法检测阳性13例，阳性率为3.85%。侧向免疫层析法检测阳性率高于血真菌培养，差异无统计学意义 (χ2=3.65，P>0.05)。两者联合检测一项或两项阳性14例，阳性率为4.14%。两者一致性比较具体见表5。

2.7 脑脊液真菌培养与侧向免疫层析法检测结果比较

284例AIDS患者同时做脑脊液培养与侧向免疫层析法检测，脑脊液真菌培养阳性25例，阳性率为8.80%；侧向免疫层析法检测阳性68例，阳性率为23.94%，侧向免疫层析法检测阳性率高于脑脊液培养，差异有统计学意义 (χ2=23.77，P<0.01)。两者一致性具体见表6。

表5338例艾滋病患者血培养与血侧向免疫层析法检测结果一致性比较

Tab.5Comparison of the results of blood culture and blood lateral immunochromatographic assay in 338 patients with AIDS

血真菌培养血侧向免疫层析法检测阳性阴性合计阳性415阴性9324333合计13325338

表6284例艾滋病患者脑脊液培养与侧向免疫层析法结果一致性比较

Tab.6Comparison of results of cerebrospinal fluid culture and lateral immunochromatography in 284 AIDS patients

脑脊液真菌培养脑脊液侧向免疫层析法阳性阴性合计阳性24125阴性44215259合计68216284

3 讨 论

有文献报道发达国家AIDS患者未经抗逆转录病毒之前，隐球菌播散性感染发生率为5%～8%[2]。本院收治的AIDS患者中，隐球菌播撒性感染率为10.56%稍高于文献报道。

隐球菌感染检测方法中，墨汁染色是最常用的方法，操作简单，用时短，约需2 min，阳性率为54%～74%[3]。艾滋病合并隐球菌性脑膜炎患者，墨汁染色的敏感性为80%～85%[4]，可快速诊断隐球菌感染。其适用的标本类型为无菌体液、尿液等，灌洗液、支气管刷取物和少量痰加水漩涡振荡后，取上清，也可进行墨汁染色。体液标本经离心沉淀后再进行墨汁染色，可提高阳性率。本院采用离心沉淀后墨汁染色，328例AIDS患者脑脊液隐球菌检出率为17.99%。墨汁染色结果易受菌量多少、实验室人员技术能力、墨汁质量等影响，造成假阳性和假阴性结果出现。一般脑脊液和墨汁的比例为5∶1左右为宜，最好选用接种枪加墨汁和标本，即取10 μL墨汁和50 μL脑脊液混匀，小心盖上盖玻片，避免产生气泡，用笔轻压，先低倍镜观察，以见到细小墨汁颗粒为找到视野，再观察全片，低倍镜下阅片不少于300个视野，当黑色或棕色背景下看到无色的、很亮的晕圈，晕圈内可见清晰圆形或椭圆形孢子，再转高倍镜确认，隐球菌高倍镜下可见到完整光滑细胞壁及胞内脂质颗粒。若低倍镜下，仅看到漆黑，为墨汁量过多，可轻压盖玻片，用滤纸吸去多余染液再观察，否则易造成假阴性结果。低倍镜观察时，要先将聚光镜下调，光圈缩小，可观察到隐球菌清晰的细胞壁。选择颗粒细的墨汁为佳，根据墨汁不同，适当调整脑脊液与墨汁的比例，可有效提高墨汁染色隐球菌的检出率。墨汁染色时，红酵母菌和白吉利毛孢子菌可造成假阳性结果。有文献报道将阿利新蓝染色用于脑脊液隐球菌的检测，检出阳性率也可达80%～90%[5]，隐球菌经阿利新蓝染色后，荚膜可被染成深蓝色，菌体呈淡蓝色，而周围的炎性细胞不着色，染色对比清晰，当隐球菌数目少时也容易观察，较传统墨汁染色隐球菌检出率高，有条件的实验室可考虑使用。

真菌培养是通过对标本进行培养和鉴定，判断患者是否发生隐球菌感染，一般需要28℃和35℃培养3～4 d,个别新生隐球菌需要延长培养时间到1周以上，为现阶段临床检查新生隐球菌的金标准，与涂片和隐球菌抗原检测相比，培养时间长，不利于患者病情的早期诊断。据文献报道[4]合并感染隐球菌脑膜炎的艾滋病患者，其脑脊液和血标本真菌培养的敏感性分别为90%和50%～70%，其中脑脊液培养敏感性随着标本量增加而增高 (10 μL时为82%，100 μL时94%)。本院688例AIDS患者血标本真菌培养,新生隐球菌的检出率为2.8%，与吴开进[6]报道的2.3% (6/259)血真菌培养阳性率相近。316例AIDS患者脑脊液真菌培养阳性率为8.2%。313例患者同时做了脑脊液墨汁染色和真菌培养，墨汁染色阳性率为18.21%；培养阳性率为9.27%，脑脊液墨汁染色阳性率高于真菌培养阳性率。由于本实验室血液及无菌体液真菌增菌培养使用的是一般菌需氧培养瓶，而未使用真菌专用培养瓶，培养条件为35℃，5 d，部分隐球菌可能由于培养时间短而漏检；有部分患者由于已接受过抗真菌预防治疗，菌已死而抗原存在，出现墨汁染色阳性而培养阴性。本院真菌培养阳性菌株，经VITEK 2系统鉴定，均为新生隐球菌，有文献报道[7]，API 20C系统、Vitek全自动微生物鉴定仪或MicroScan全自动微生物鉴定系统等，目前尚无法区分新生隐球菌及格特隐球菌，德国布鲁克公司的MALDI TOF MS不仅能准确区分格特隐球菌和新生隐球菌，还可进行分子分型。

隐球菌抗原 (CrAg)检测具有很高的敏感性及特异性，可在症状出现之前检测到。目前常用的检测方法有3种，分别是乳胶凝集法 (LA)、酶联免疫吸附试验 (ELISA)和侧向免疫层析法 (LFA)。3种方法均利于患者病情的早期诊断，监测隐球菌抗原滴度的下降，可作为抗隐球菌疗法有效的指示。据文献报道[4]以培养为金标准，LA在血标本和脑脊液的敏感性分别为83%～97%和93%～100%，特异性分别为93%～100%和93%～98%。ELISA法敏感度高于LA法，其检测血标本的敏感性和特异性分别为94%和96%，检测脑脊液的敏感性和特异性分别为100%和98%，但操作繁琐，需要配置额外设施，对新生隐球菌 (血清型D)和格特隐球菌 (血清型C)检测敏感性低。LA具有检测需要时间短，操作方便，其局限性为结果判读受人为因素影响较大，需要对标本进行前处理，对格特隐球菌 (血清型C)敏感性低。ELISA法和LA法试验的假阳性率为0.0%～0.4%[7]。本文采用的是LFA法，该方法是IMMY公司继乳胶凝集法后新研发的试剂盒，其在常温状态下性质稳定，操作简便且耗时短 (10 min)，对结果的判定简单、准确，标本不需前处理，敏感性高于LA法和ELISA法[8]。对所有血清型新生隐球菌和格特隐球菌均有很高的敏感性。有文献报道LFA对隐球菌病的诊断敏感性和特异性可达到100%，特别是检测低浓度的荚膜抗原方面，与LA相比具有更高的敏感性[9]。本文中1 049例AIDS患者进行LFA法检测，阳性率为10.96%；201例同时做脑脊液和血标本的LFA法检测，脑脊液阳性56例，阳性率为27.86%，血标本阳性75例，阳性率37.31%，有文献报道当CSF中隐球菌荚膜抗原检测为阳性时，血液中检测其敏感性可达99%，应用LFA检测指尖血、血清、血浆和脑脊液，CrAg的结果一致性100%[10]，说明检测指尖血CrAg简单可行性；应用LFA检测尿液及唾液中CrAg的效果差，有待进一步研究[11]。对于3例墨汁染色阳性，脑脊液LFA法检测阴性者，其中2例血清LFA法检测阳性，具体原因待研究。

总之，通过回顾性分析2017年本院收治的AIDS患者标本，用3种方法检测隐球菌的阳性率，以血培养阳性率最低，脑脊液标本墨汁染色与LFA法检测阳性率差异无统计学意义，血标本LFA法检出率最高，可作为AIDS患者合并隐球菌感染较理想的早期诊断方法。