一株感染深水网箱养殖许氏平鲉的病原菌分离与鉴定*

王 凯 王印庚 姜 勇 张 正① 于永翔 廖梅杰

(1.中国水产科学研究院黄海水产研究所 青岛 266071；2.青岛海洋科学与技术试点国家实验室海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室 青岛 266071；3.上海海洋大学水产与生命学院上海 201306；4.青岛国家海洋科学研究中心 青岛 266071)

许氏平鲉(Sebastes schlegeli)属鲉形目(Scorpaeniformes)、鲉科(Scorpaenidae)、平鲉属(Sebastes)，又称“黑鲪”、“黑石鲈”、“黑头”，在我国主要分布于黄渤海区域。因其肉质鲜美，生长速度快，耐低温，可在我国北方海域自然越冬，成为北方海水网箱养殖的主要鱼类品种之一(常青等, 2009；顾中华等, 2015)。山东省长岛县大钦岛周边是我国北方大型深水网箱养殖的最大集中地，养殖的主要品种就是许氏平鲉。经过20年余的发展，随着该海区深水网箱养殖规模不断扩大，疾病的发生也越来越频繁，成为影响养殖成活率的关键因素。特别是近几年来，该海区养殖的许氏平鲉疾病呈现了传染速度快、死亡率高等突出特点，已经严重影响了正常的养殖生产。

2016年 7～9月，大钦岛周边海域深水网箱养殖的许氏平鲉再次发生大规模的疾病，引发了较为严重的死亡现象。病鱼的主要临床症状表现为：表皮出现明显创伤性溃疡，鳍条溃烂，个别病鱼眼球突出、溃烂。本研究通过现场采集发病鱼样品，对病鱼体表病灶和肠道、肝脏、肾脏等内脏器官进行了病原菌分离，通过人工感染实验验证其致病性，并对病原菌的形态特征、生化特性、分类地位及药物敏感性等进行了分析，以期为防控该病提供借鉴和参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验所用病鱼取自山东省长岛县大钦岛周边深水网箱，具有典型的皮肤溃疡等临床症状。人工感染用鱼购自威海某育苗场，体重(37.1±5.0) g。

1.2 实验方法

1.2.1 病原菌分离纯化与形态观察 现场采集具有典型症状的病鱼带回实验室进行病原学检验。解剖前，取病鱼的黏液、病灶、鳃等组织制成水浸片，观察是否有明显寄生虫及霉菌。无菌解剖后取病灶、肠、肝、肾等组织用 2.5%戊二醛固定液处理，透射电镜观察是否有病毒侵染。取病灶、肠、肝、肾等组织用1.5%灭菌生理盐水人工匀浆，适当稀释后分别涂布于TSB和TCBS琼脂培养基上，28℃培养24 h后计数观察，观察优势菌情况并进行分离、纯化培养，纯化后的菌株用20%甘油生理盐水保存于-80℃冰箱备用。

1.2.2 人工感染实验 将分离纯化的优势菌接种于TSB琼脂培养基上，28℃培养24 h，用1.5%灭菌生理盐水冲洗菌苔，经分光光度法和平板计数法测定其菌悬液浓度为5.2× 109CFU/ml。用生理盐水对该菌悬液进行梯度稀释后分别制成 5.2×108、5.2×107、5.2×106、5.2×105CFU/ml的菌悬液用于感染试验的注射菌液。取健康许氏平鲉140尾，分为7组，即5个实验组、1个阴性对照组和 1个空白对照组，每组20尾。实验组从背部肌肉注射(王晓冉等, 2017) 0.1 ml的菌液，阴性对照组注射等量的1.5%灭菌生理盐水，空白对照组不做处理。饲养条件为160 L塑料桶，水温控制在17～19℃。注射后观察记录鱼的症状和发病死亡情况，对病鱼及时进行病原菌分离和鉴定。

1.2.3 病原菌理化特性研究 将病原菌接种于TSB和TCBS琼脂培养基上，观察菌落形态和大小。对细菌进行革兰氏染色观察，同时，用 2.5%戊二醛固定液处理，透射电镜下观察细菌形态。在无菌条件下挑取单一纯菌落制备菌悬液，用常规的生理生化试剂盒(青岛海博生物技术有限公司)对病原菌进行理化特性测定。

1.2.4 菌株gyrB和16S rDNA基因序列测定和系统发育树分析 挑取单菌落于50 µl去离子水中反复吹打，99℃金属浴 10 min，12000 r/min 离心 1～2 min，取上清液作PCR模板。gyrB基因序列的PCR扩增引物为 UP-1 (正向引物)：5'-GAAGTC ATCATGACCGTTCTGCA(C/T)GCAGGAGGCAA(A/G)TTCGA-3'和UP-2r (反向引物)：5'-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCATCGAC (A/G)TCGGCGTCCGTCAT-3'。16S rDNA基因序列的PCR 扩增引物为27F (正向引物)：5'-AGA GTT TGA TC(C/A) TGG CTC AG-3'和1492R(反向引物)：5'-RGGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3'。PCR 反应体系 50 μl，包括 2 μl DNA 模板，5 μl 10×PCR Buffer，4 μl dNTP (2.5 mmol/L)，0.5 μlTaqDNA酶(5 U/μl)，正反向引物各 0.8 μl (10 μmol/L)，用灭菌双蒸水补足至50 μl。扩增条件为：94℃预变性5 min，94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min 20 s，30 个循环，72℃延伸10 min，4℃保存。扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳纯化，使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收产物。

取回收的产物用pMD18-T载体连接，混匀后加入SolutionI，16℃金属浴中连接6 h以上。将连接产物转化到感受态细胞 DH-5α中，挑选有插入目的片段的阳性克隆送上海生工生物工程股份有限公司测序。将gyrB和16S rDNA基因序列通过NCBI的Blast检索系统进行序列同源性分析，从中分别选取与所获的序列同源性较高的菌株的gyrB和16S rDNA基因序列，用 Mega 6.0采用邻接法(Neighbor-joining method)获得系统发育树，并通过 Bootstrap法(1000次重复)检验。

1.2.5 药物敏感性实验

采用纸片扩散法对菌株进行药物敏感性测试。抗菌纸片采用杭州天和微生物试剂公司的药敏纸片试剂盒，将抗菌纸片贴于涂满菌液的 MH琼脂培养基上，28℃培养18～24 h后，参考陈建国等(2017)记录菌株对抗菌药物的敏感性。

2 结果

2.1 病鱼检查

患病许氏平鲉初期摄食下降，贴于网箱壁缓慢游动，中后期躯体表面出现创伤溃疡，鳍条略有溃烂。解剖病鱼发现肠壁透明，有少量积水，肝脏质地松散，颜色较浅。黏液、病灶和鳃等器官组织水浸片检查未见寄生虫和真菌，光学显微镜下观察无寄生虫和真菌；透射电镜观察病灶、肠、肝、肾等组织无病毒粒子出现(图1)。

图1 患病许氏平鲉体表溃疡Fig.1 The diseased S.schlegeli with skin ulcer

2.2 病原菌的形态观察

从病鱼病灶中分离出一株具有绝对优势的菌株，命名为BZ01。对BZ01进行分离纯化培养，在TSB琼脂平板培养18～24 h后菌落呈半透明圆形，表面光滑，中央略隆起，直径多在2 mm左右(图2A)，同时菌落有明显臭味。在TCBS上该菌也可生长，菌落圆形光滑、边缘整齐、隆起、呈绿色(图2B)。革兰氏染色呈阴性，短棒状(图2C)。透射电镜观察, 菌株呈短杆状、两端钝圆, 具单根极生鞭毛, 菌体大小约为1.8 μm×0.8 μm (图 2D)。

图2 菌株的形态特征Fig.2 Morphological characteristics of the strain

2.3 致病性验证

感染试验共进行12 d，以注射结束后24 h计为1 d，以此类推。如图 3 所示，5.2 × 109、5.2 × 108、5.2 × 107、5.2 × 106CFU/ml实验组的许氏平鲉均在注射菌液2 d后出现死亡。其中，5.2 × 109CFU/ml组在第3天全部死亡，5.2×108CFU/ml组在第5天全部死亡，5.2×107CFU/ml组在第7天全部死亡。低浓度组(5.2×105CFU/ml组)在第5天开始出现死亡，实验结束时累计死亡率为65%。阴性对照组和空白对照组均无死亡。人工感染后实验鱼摄食量减少，贴于桶壁缓慢游动、活力下降，注射处出现红肿，皮肤出现点状溃疡、出血，后期溃疡创面逐渐扩大，部分病鱼会出现腹水和白便现象，与自然感染下症状一致，而阴性对照组和空白对照组未出现任何异状。参考李长红等(2009)的改良寇氏法，计算出菌株 BZ01对许氏平鲉12 d 的 LD50为 2.07×106CFU/ml。

图3 菌株BZ01人工感染实验结果Fig.3 The artificial infection results of the strain BZ01

2.4 病原菌理化特性和药物敏感性测定

菌株BZ01的理化特性结果见表1。可利用葡萄糖、甘露醇和阿拉伯糖，不利用蔗糖和乳糖，氧化酶阳性，鸟氨酸水解酶和赖氨酸水解酶阳性，精氨酸双水解酶阴性，其理化特性与轮虫弧菌标准菌株LMG21460T仅在密二糖和西蒙氏枸椽酸盐 2个指标上有差异。

2.5 病原菌gyrB和16S rDNA基因序列测定和系统发育树分析

由引物UP-1和UP-2r扩增菌株BZ01的gyrB基因序列，获得有效基因序列长度为1141 bp，通过Blast检索发现其与弧菌属同源性较高。其中，与轮虫弧菌(Vibrio rotiferianus)同源性达99%。从NCBI数据库中调取相似度最高的10个菌株的gyrB基因序列构建系统发育树，结果如图4所示，菌株BZ01与轮虫弧菌聚合，置信度为100%。

表1 菌株BZ01的生理生化特征Tab.1 The biochemical reaction of the strain BZ01

由引物27F和1492R扩增菌株BZ01的16S rDNA基因序列，获得有效基因序列长度为1480 bp，通过Blast检索发现其与弧菌属序列同源性最高。其中，与轮虫弧菌(Vibrio rotiferianus)、哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)、坎氏弧菌(Vibrio campbellii)及需钠弧菌(Vibrio natriegens)序列均有较高相似度。从以上相似度最高的序列中选择12个菌株的16S rDNA基因序列构建系统发育树，结果如图5所示，菌株BZ01与轮虫弧菌聚合，置信度为51%。

综合gyrB和16S rDNA基因序列鉴定结果，将菌株BZ01鉴定为轮虫弧菌。

2.6 药敏实验

对菌株BZ01进行30种抗菌药物的敏感性实验，结果显示，该菌株对菌必治、新霉素、四环素、氧氟沙星、氟哌酸、氟罗沙星、新生霉素、强力霉素、萘啶酸和氟苯尼考10种药物高度敏感，对美满霉素和头孢噻肟 2种药物中度敏感，而对青霉素、吡哌酸、头孢他啶、链霉素、头孢氨苄、头孢拉定、先锋必、头孢唑啉、乙酰螺旋霉素、克拉霉素、阿米卡星、庆大霉素、阿奇霉素、卡那霉素、苯唑青霉素、氨苄青霉素、多粘菌素B、复方新诺明18种药物耐药。

图4 基于gyrB基因序列构建的系统发育树Fig.4 The phylogenetic tree based on gyrB gene sequence alignment

图5 基于16S rDNA基因序列构建的系统发育树Fig.5 The phylogenetic tree based on 16S rDNA gene sequence alignment

3 讨论

山东省长岛县作为中国北方最大的深水网箱养殖基地，在冷水性鱼类尤其是许氏平鲉的网箱养殖中占有极其重要的地位。但近年来随着养殖规模的不断扩大，加之当地渔民传统作业生产中大量使用冰鲜杂鱼饵料，致使水中有害微生物逐渐增多，疾病频繁暴发，给当地渔业发展造成巨大的经济损失。其中，细菌性疾病更以其高传染率和死亡率成为限制行业发展的关键因素。目前，已报道的可对许氏平鲉致病的细菌主要有β-溶血性链球菌(β-heamolytic streptococcus)(Masahiroet al, 1986)格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)(Kanget al, 2004)、杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida) (Hanet al, 2011)、哈维氏弧菌(Vibrioharveyi) (孟鹏等, 2010； Wonet al, 2008)、海分枝杆菌(Mycobacterium marinum) (绳秀珍等, 2011)、鳗利斯顿氏菌(Listonella anguillarum) (王庚申等, 2012)等。

本研究从患有皮肤溃疡症的许氏平鲉体表病灶分离到一株绝对优势菌，通过回归感染试验，验证该菌对许氏平鲉具有较强的致病力，人工感染后的许氏平鲉表现出体表溃疡等与自然感染相同的症状。经细菌形态特征、生理生化、gyrB和16S rDNA基因序列比对分析等多种方法将该菌株鉴定为轮虫弧菌。国外有关轮虫弧菌的报道始见于 2003年，由 Gomez-Gil等(2003)在褶皱臂尾轮虫中分离得到，此后陆续出现有关于该菌的报道(Chowdhuryet al, 2011； Labbateet al, 2011)。近几年来，国内分别在养殖半滑舌鳎(陈政强等, 2012)、南美白对虾(金春英, 2013)和线纹海马(杨求华, 2017)中发现了轮虫弧菌。感染该菌的半滑舌鳎主要症状为体表溃烂、尾部出血。患病南美白对虾主要症状为体表发红、肌肉白浊、鳃部变黄溃烂。而患病线纹海马主要症状为腹部凹陷，尾部呈L形，尾末端表皮脱落、溃烂等。但轮虫弧菌感染游泳性鱼类发病的案例尚未见报道。值得一提的是，本研究得到的轮虫弧菌在TCBS培养基上菌落为绿色，说明其不发酵蔗糖，因此，不能采用TCBS培养基对其进行定性鉴定。从16S rDNA和gyrB基因序列系统发育树上看, 根据16S rDNA基因序列建立的发育树置信度普遍较低, 菌株BZ01与轮虫弧菌(NR04281.1)置信度为51%，远低于gyrB基因序列系统发育树的置信度。因此，在区分亲缘关系较近的种类时，gyrB基因序列更为适合做分类研究(王晓冉等, 2017)。

表2 菌株BZ01对抗菌药物的敏感性测试Tab.2 The drug sensitivity test of strain BZ01

从药敏实验结果来看，此次分离的轮虫弧菌对不同类抗菌药物的敏感性不同。其中，对四环素类(四环素、强力霉素)、喹诺酮类(氧氟沙星、氟哌酸、氟罗沙星、萘啶酸)、香豆素类(新生霉素)、肽酰转移酶类(氟苯尼考)高度敏感，而对大环内酯类(克拉霉素、乙酰螺旋霉素、阿奇霉素)、多肽类(多粘菌素B)、磺胺类(复方新诺明)、β-内酰胺类(青霉素、苯唑青霉素、氨苄青霉素、头孢他啶、头孢氨苄、头孢拉定、头孢唑啉、头孢噻肟、先锋必)、氨基糖苷类(链霉素、庆大霉素、卡那霉素、阿米卡星)中度敏感或不敏感。而在海马中发现的轮虫弧菌(杨求华等, 2017)对头孢类和氨基糖苷类敏感，对四环素类和喹诺酮类耐药，这与本次得到的轮虫弧菌药物敏感性不同，这说明同种细菌不同菌株也会因养殖环境不同而表现不同的耐药性。因此，养殖生产中应当合理筛选和使用抗菌药物，既要达到理想的预防治疗疾病效果，更要避免细菌耐药性的产生。