人类精子冷冻损伤与保护的相关研究

董俏言 石 慧综述 李建远，2∗审校

1.烟台大学生命科学学院(264000)；2.国家卫生健康委科学技术研究所，国家卫生健康委男性生殖健康重点实验室

精子冻存技术对于辅助生育、生育力保存和科学研究具有重要意义。我国的高不育率及辅助生殖技术的低成功率，均提示需要提高精子的冻存技术，为临床提供更高质量的精子。本文对精子冷冻损伤和冷冻保护的相关研究综述如下。

1 冷冻损伤

冷冻复苏可以导致冰晶形成、氧化－还原反应失衡，以及生物大分子改变。

1.1 冰晶形成

精子细胞膜具有较高的流动性，水含量较低，仅有50%，使得精子对冷冻损伤不敏感。但是在冷冻过程中，温度的巨大变化、渗透压的改变以及细胞内冰晶的形成均会导致其结构和功能的损伤[1-2]。在冷冻过程中，冷冻速率决定精子冻伤的程度。过快降温导致胞内水分流出细胞膜受阻，产生胞内冰晶，破坏细胞膜，影响细胞器功能，进而导致细胞死亡；过慢的降温使胞内的水分通过细胞膜流出，细胞质浓缩，胞内渗透压增加，细胞脱水[3]，也会因为胞内盐浓度增加，造成盐害。过快或过慢降温均能造成细胞冷冻损伤。

1.2 氧化－还原反应失衡

正常的精子存在抗氧化防御系统，如精子中的抗氧化蛋白家族，精浆中过氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶，以及非酶抗氧化剂。氧化应激是由细胞中活性氧(ROS)和抗氧化剂防御的失衡引起的，导致细胞成分损害，使必需的代谢酶失活，并破坏信号传导途径。在冷冻过程中，精浆中的抗氧化物质被稀释，精子中的氧化防御能力被削弱，平衡被打破，精子中ROS积聚会对细胞内的DNA、蛋白质以及膜脂质造成损伤，并且会诱导细胞色素C和来自线粒体的凋亡因子的释放，最终导致细胞凋亡[4]。

1.3 生物大分子改变

精子经过冷冻复苏后，精子的膜结构受损。同时膜本身的蛋白、磷脂和多糖，以及核酸均会发生改变。

1.3.1 蛋白质 精子蛋白的改变通常是表达量的变化，即表达量增加或降低。目前认为，表达量降低是因为蛋白质的降解，或者蛋白质在精子中迁移的结果；表达量增加的机制还不明确。精子在冷冻复苏过程中蛋白表达活动不活跃，磷酸化、蛋白翻译后修饰、二级或三级结构变化或蛋白转移可能是精子蛋白表达量增加的原因[5]。

1.3.2 磷脂 冷冻复苏能够引起精子膜磷脂的显著变化，冷冻后精子会失去大量的磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺，增加胆固醇的含量[6]，以及导致各种磷脂脂肪酸的含量发生变化，内侧磷脂层中磷脂酰丝氨酸和磷脂酰甘油增加，外层磷脂层中磷脂酰乙醇胺、二磷脂酰甘油和磷脂酰肌醇增加[7-8]。

1.3.3 多糖 精子表面有一个复杂的糖蛋白复合物，含有大量的O-糖蛋白和N-糖蛋白。在冷冻复苏过程中，糖蛋白种类发生改变。其中，人类精子中半乳糖和N-乙酰半乳糖胺的含量明显降低[9]。

2 冷冻保护

近年来，关于如何提高精子冷冻复苏效果的报道越来越多。主要通过冷冻复苏过程中的几个阶段实现，即精子优选、冷冻保护剂、冻存方法等。

2.1 精子优选

一般情况下，冷冻前精子质量越高，复苏后精子质量越好，因此可通过精液常规参数分析筛选高质量精液样本进行冷冻保存；精浆成分对精子的冷冻损伤具有一定的保护作用，利用耐冻性好的精浆添加或置换不育患者精浆，可得到较好的复苏效果[10]。精液的耐冻性与季节有关，3～9月呈明显下降趋势，冬季和春季有利于供精者精液储存[11]。精子分别在离体60min与30min时冷冻保存，其复苏率有差异，尽快冻存有助于提高精子的冷冻复苏率[12]。

2.2 冷冻保护剂

现有的冷冻保护剂根据其功能分为三大类：抑制冰晶的形成，调节氧化－还原反应平衡，保护精子功能。

2.2.1 抑制冰晶的形成 甘油、二甲基亚砜、三羟甲基氨基甲烷、乙二醇等为渗透性保护剂，可以减轻细胞渗透性肿胀，减缓细胞脱水速度；糖类、脂类和蛋白质作为膨胀剂，提高冷冻延长剂的玻璃化转变温度；高温处理的牛奶和蛋黄经常作为膜修饰剂，增强精子的冷冻稳定性[13]。相比葡萄糖、3-O-甲基-D-吡喃葡萄糖、棉子糖或水苏糖，海藻糖和蔗糖是更有效的冷冻保护剂[14]。

2.2.2 调节氧化－还原反应平衡 冷冻精子过程中产生的大量ROS，可破坏精子中的氧化－还原平衡，同时对生物大分子具有氧化作用。目前，已发现大量的物质能够缓解ROS损伤。在精子冷冻保护剂中添加抗氧化剂，如抗坏血酸、过氧化氢酶、谷胱甘肽(GSH)、维生素E和乙酰左旋肉碱，可以抑制ROS的活性，从而提高精子冷冻复苏率、精子活力及精子DNA的完整性，抵抗过量ROS引起的氧化应激损伤[15-18]。Liu等[19]在冷冻保护剂中添加人凝血酶抗凝血酶复合物(TAT)过氧化物酶2融合蛋白，显著降低了细胞内的ROS和丙二醛水平，提高了冷冻复苏后精子的活力，缓解了DNA损伤，也明显降低了自发顶体反应，增加了钙离子载体诱导的顶体反应。3m M褪黑素通过PI3K/Akt信号途径调节蛋白激酶B(Akt)和天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)，进而降低细胞内ROS含量，增加精子活力，减少精子凋亡和死亡，在人类精子冷冻复苏过程中保护精子远离损伤[20]。另外，Hatef等[21]研究发现基质细胞衍生因子-1α(SDF-1α)通过减少线粒体ROS的生成减缓精子氧化应激损伤，减缓冷冻复苏过程中的细胞凋亡。此外，植物提取物，如白藜芦醇、槲皮素、黄芪多糖、染料木素、番茄素、丝胶、迷迭香等具有很强的抗氧化能力，而且毒性低[22-27]。

2.2.3 保护精子功能 冷冻复苏过程中，精子功能蛋白的改变影响精子功能。绵羊的精浆蛋白(BSP1和BSP5)在精子获能、精卵相互作用中起着关键性作用[28]。将其添加到冷冻保护剂中可以防止精子膜损伤、增加精子活力、降低酪氨酸磷酸化水平，也可以修复冷休克精子膜损伤[29-30]。卵母细胞、子宫内膜和滤泡液中的SDF-1α能够提高精子活力，维持正常线粒体状态[31-32]。肝素与输卵管蛋白联合添加应用，可以改善复苏后精子在体外粘液穿透能力[33]。这也表明，由于冷冻损伤的多方面性质，需要几种蛋白质联合应用以改善精子的受精能力。

2.3 冻存方法

现有的精子冷冻保存方法主要包括4种，分别是慢速冷冻法、快速冷冻法、玻璃化冷冻法及冷冻干燥法。

2.3.1 慢速冷冻法和快速冷冻法 根据控温方式的不同，分为手动控温法和程序控温法，无论是手动还是程序操作，均对精子产生物理或化学损伤[34]。快速冷冻法相对慢速冷冻法操作简单，但是存在很多缺陷，如无法有效的控制冷冻曲线，液氮液面上15～20cm处的温度不稳定(-70℃、-80℃或-99℃)[35]；尝试调节慢速冷冻法的降温速率(20、40和60℃/min)，复苏后精子活力、活精子率、顶体完整性和质膜完整性显著高于快速冷冻法[36]。慢速冷冻法温度降低速率也不是越快越好[37]。快速和慢速两种方法均能显著降低正常精子形态和DNA完整性的百分比，但两种方法没有差异[38]。

2.3.2 玻璃化冷冻法 仍处于探索阶段，研究显示，玻璃化冷冻法不需要冷冻保护剂，活精子比率明显高于慢速冷冻法，顶体保存较好，DNA碎片平均比慢速冷冻法减少1/3[39-40]。有研究检索2428篇文章，涉及486个玻璃化冷冻和486个常规冷冻保存精子样本(包括慢速冷冻或快速冷冻法)，玻璃化冷冻后解冻精子的总运动活力和前向运动活力明显更高，但是两种方法对精子DNA损伤以及形态的影响无明显差异[41]。

2.3.3 冷冻干燥法 已经被成功用于动物精子的冷冻保存，冷冻干燥法的最大优点是，精子样本可以长期保存在4℃冰箱中，甚至在室温下保存。将小鼠和大鼠的精子用含有10m M Tris和1m M EDTA的溶液(p H＝8.0)冷冻干燥后，在4℃下可以保存3～5年[42]。在乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇四乙酸(EGTA)等螯合剂与迷迭香酸(RA)配合使用时，提高冷冻干燥后精子DNA的完整性，但不能够促进受精和胚胎发育[43]。

2.4 复苏方法

现有的复苏方法主要是37℃水浴，但有研究认为40℃具有更高的冷冻复苏率，但是复苏后精子的活力、顶体状态、DNA完整性、ATP酶含量没有显著改善[44]。2015年有研究者尝试在38℃、40℃、42℃的不同温度下孵育5s和10s，经计算机辅助精子分析(CASA)和低渗膨胀试验，显示42℃水浴环境中复苏玻璃化冷冻精子，精子活力和质膜完整性更佳[45]。

3 小结

目前国际上已经存在多种人类精子冷冻保存技术，但每项技术都存在不同程度的缺陷，其主要表现在冷冻复苏后精子质量不同程度下降。笔者认为，深入了解冷冻复苏影响精子质量的分子机制，创新技术方法，建立人类精子质量分子评价技术，是解决此难题的重要途径。