检测血清miR-181b、miR-210诊断妊娠期高血压疾病价值

李艳丽 宋 琛 李冬静 王艳芬 赵淑蕊

河北省唐山市丰南区医院(063300)

妊娠期高血压疾病是妊娠期妇女特发疾病[1]。不仅造成孕妇免疫功能下降，还可影响孕妇的抗氧化能力等一系列血清学表现，寻找诊断标志物具有临床意义[2]。研究表明微小RNA-181b(miR-181b)可在机体免疫系统中发挥重要功能并参与多种疾病的发生进展[3]。相关研究表明微小RNA-210(miR-210)在子痫前期孕妇的胎盘组织及外周血中均呈高表达，并与子痫前期的发生发展密切相关[4]。关于miR-181b、miR-210在妊娠期高血压疾病中的研究相对较少，因此本研究探讨miR-181b、miR-210联合检测的临床诊断价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2016年3月—2017年2月本院治疗的妊娠期高血压疾病患者作为观察组，另选取同期健康检查孕妇为对照组。纳入标准：①诊断标准符合《妇产科学》[5]；②单胎妊娠；③无原发性高血压。排除标准：①合并糖尿病、肾脏或血液系统疾病；②肝肾功能严重损伤；③多胎妊娠；④凝血功能障碍；⑤心肺功能不全。

1.2 主要试剂

RNA提取试剂盒购自美国Invitrogen公司；QPCR试剂盒购自日本Ta KaRa公司；qRT-PCR试剂盒购自Thermo Fisher Scientific公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成；Nanodrop核酸测定仪器购自德国NanolytiK公司；CFX96PCR仪器购自Beckman公司。

1.3 qRT-PCR法检测miR-181b、miR-210

采集所有孕妇清晨空腹静脉血抗凝后离心，血清-20℃保存。采用RNA提取试剂盒提取血清总RNA，利用反转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA。按照SYBR Green RCR master mix试剂说明配反应体系并加样。qRT-PCR反应体系共为20μl，其中SYBR Premix Ex TaqⅡ(2×)10μl，cDNA 2.0 μl，上下游引物各0.8μl，ROX Reference DyeⅡ(50×)0.4μl，dd H2O 6.0μl。miR-181b、miR-210均以U6为内参基因，引物设计见表1。q RT-PCR反应条件：98℃30s，95℃15s，72℃15s，共40个循环。对所得数据Ct值进行分析，采用2-ΔΔCt算法计算miR-181b、miR-210的相对表达量。

表1 qRT-PCR引物序列

1.4 阳性判定标准及观察指标

通过ROC曲线分别评估miR-181b、miR-210妊娠期高血压疾病最佳截断值，联合检测时有一项为阳性即判定为阳性，并评估不同诊断方案相关指标。采用免疫比浊法测定血清C反应蛋白(CRP)指标，循环酶法测定血清同型半胱氨酸(Hcy)指标，观察血清总抗氧化能力(TAC)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)。

1.5 统计学方法

采用SPSS21.0对数据进行分析，计量资料符合正态分布的数据均以(±s)表示，多组间比较行单因素方差分析，两组间比较采用t检验；计数资料采用χ2检验；Pearson法进行相关性分析；采用ROC评估miR-181b、miR-210诊断价值及最佳截断值。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两组孕妇一般资料比较

两组各纳入96例，两组孕妇年龄、孕周比较无差异(P＞0.05)，观察组孕妇血清Hcy、CRP、MDA水平高于对照组，TAC、SOD、GSH-Px水平低于对照组(P＜0.05)，见表2。

2.2 血清miR-181b与miR-210表达及与临床指标相关性

观察组血清miR-181b(2.14±0.23)、miR-210(1.27±0.15)水平均高于对照组(1.02±0.16、0.98±0.13)(P＜0.05)。患者血清miR-181b、miR-210水平均与Hcy、CRP、MDA呈正相关，与TAC、SOD呈负相关(均P＜0.05)；与GSH-Px无相关性(P＞0.05)，见表3。

表2 两组孕妇一般资料比较(±s)

表2 两组孕妇一般资料比较(±s)

项目 对照组(n＝96)研究组(n＝96) t P 项目 对照组(n＝96)研究组(n＝96) t P年 龄(岁) 29.1±4.2 28.5±3.9 1.048 0.296 TAC(U/ml) 13.36±4.45 8.56±2.85 8.900 0.000孕 周 25.6±4.6 25.3±3.9 0.507 0.613 MDA(μmol/L)21.27±7.09 28.83±9.61 6.203 0.000 Hcy(μmol/L) 10.30±3.43 15.23±5.04 7.923 0.000 SOD(n U/ml) 96.37±6.55 86.19±5.36 11.785 0.000 CRP(mg/dl) 1.45±0.48 2.01±0.67 6.657 0.000 GSH-Px(U/L)93.16±6.58 84.27±7.12 8.985 0.000

表3 miR-181b、miR-210表达与临床指标相关性

2.3 miR-181b与miR-210诊断效能

miR-181b诊断ROC曲线AUC为0.888，最大约登指数0.773，截断值1.50，此时灵敏度57.3%，特异度76.0%，见 图1。miR-210诊 断ROC曲 线AUC为0.908，最大约登指数0.732，截断值为1.10，此时灵敏度55.2%，特异度为75.3%，见图2。

图1 miR-181b ROC曲线

图2 miR-210 ROC曲线

2.4 联合检测与单项检测诊断效能对比

将单项检测与联合检测诊断效能对比分析，miR-181b＋miR-210联合检测时诊断灵敏度、准确度均高于单项检测(P＜0.05)，见表4。

表4 各检测方法诊断效能比较(%)

3 讨论

妊娠高血压疾病以高血压、蛋白尿、水肿等全身功能紊乱为主要临床特征[6]。以往研究认为滋养细胞生物学功能异常会引起母体胎盘缺血缺氧导致临床症状进而严重影响胎儿生长发育，而部分研究发现免疫系统失调是发病主要因素[7-8]。miRNAs可参与调控细胞增殖、分化及凋亡等生理病理过程，在滋养细胞中表达异常与妊娠类疾病发生有关[9]。在血流中含量丰富且样本易获得、重复性高，一些血清/血浆中的miRNAs有望成为妊娠相关疾病诊断的标志物。因此，研究miRNAs对妊娠期高血压疾病诊断具有重要临床意义。

相关研究表明，miR-181b可参与T细胞、B细胞分化调控及免疫应答过程[10]；可在子宫内膜与早孕脱膜中表达并参与蜕膜化及维持早孕过程[11]；可通过调控靶基因金属肽酶抑制剂3(TIMP3)表达而参与妊娠期高血压疾病及其引起的心脏病发生发展过程[12]。本研究观察组血清miR-181b水平高于对照组。有研究发现，妊娠期高血压疾病患者Hcy、CRP、TAC、MDA、SOD、GSH-Px等表达异常[13]。本研究结果显示观察组血清Hcy、CRP、MDA水平均高于对照组，TAC、SOD及GSH-Px水平降低，miR-181b与Hcy、CRP、MDA呈正相关，与TAC、SOD呈负相关。miR-210在细胞增殖、分化及对低氧的适应性反应中发挥调控作用[14]。孕妇体内高表达miRNA-210可引起滋养细胞功能异常导致胎盘血液供应不足[15]。在子痫前期胎盘滋养细胞上miRNA-210上调表达并可调控细胞分化、增殖及线粒体呼吸等过程[16]。缺氧状态下miRNA-210表达升高可用于筛查孕妇子痫前期发病风险[17]。miRNA-210可参与多种妊娠相关疾病的发病过程并可作为潜在生物标志物[18]。基于此，本研究检测血清miRNA-210水平显示，观察组miRNA-210水平高于对照组，且miR-210与Hcy、CRP、MDA呈正相关，与TAC、SOD呈负相关。miR-181b、miR-210均与妊娠高血压疾病发生有关，提示其可能作为临床诊断妊高症的重要指标。ROC曲线分析显示，miR-181b、miR-210诊断妊娠期高血压疾病均具有一定灵敏性与特异性，而二者联合检测诊断灵敏度、准确度均提高。

综上所述，miR-181b、miR-210在妊娠期高血压疾病患者血清中表达升高，二者联合检测可提高诊断效能。本研究仅对患者血清水平进行检测，胎盘组织中二者表达情况及其具体作用还有待深入研究。