超微粉碎辅助提取黑豆皮水溶性膳食纤维及其特性研究

乔小全 任广跃 段 续 陈 曦 刘军雷李叶贝 屈展平 黄 菊

(河南科技大学食品与生物工程学院；食品加工与安全国家实验教学示范中心，洛阳 471023)

黑大豆,异名乌豆、橹豆、枝仔豆、冬豆子,为豆科植物大豆[Glycinemax (L.)Merr.]的黑色种子，因其具有较高的营养价值，被赋予“豆中之王”的美誉[1]。黑大豆是传统的药食同源农产品，其种皮是优质膳食纤维的理想来源，在改善润肠通便以及对糖尿病、高血压、肥胖症、心血管疾病等慢性非传染性疾病具有预防和保健作用[2-3]。在黑豆油的生产加工过程中，黑豆皮是主要的废弃物，含有丰富的纤维素、维生素、多糖等多种营养物质，充分利用黑豆皮制备水溶性膳食纤维，可弥补黑豆皮研究领域空缺，具有一定的市场价值和良好的经济前景[4]。

膳食纤维根据其水溶性可分成水溶性膳食纤维(Soluble Dietary Fiber，SDF)和非水溶性膳食纤维(Insoluble Dietary Fiber，IDF)两大类[5]。冯子倩等[6]采用碱性过氧化氢法提升黑豆皮水溶性膳食纤维产率并探究改性后的水溶性膳食纤维具有显著的胆酸结合能力。罗磊等[7]利用超微粉碎辅助酶法技术在提高绿豆皮水溶性膳食纤维产率的同时改善了其物理特性。刘博等[8]对可溶性膳食纤维的生理功能进行了研究，表明水溶性膳食纤维具有降低血糖、血脂以及预防心血管疾病、预防肿瘤发生等多种生理功能；罗磊等[9]发现了绿豆皮水溶性膳食纤维具有提高机体清除自由基的能力。迄今为止，国内外主要利用绿豆皮、癞葡萄渣、梨渣、椪柑渣、芦笋、米糠[9-14]等原料制备水溶性膳食纤维。近年来，国内外主要集中于对黑豆皮色素的提取及相关性质研究，但关于以黑豆皮为原料，采用超微粉碎辅助酶水解技术制备水溶性膳食纤维鲜见报道。

超微粉碎技术具有使粉体颗粒微细化，孔隙率和比表面积增加的功能，可显著提高膳食纤维的物化特性且对操作设备、工艺要求不高，成本相对较低[15]。酶水解技术具有降解细胞壁，有效减小提取阻力，进而提高提取效率，缩短提取时间。此外，酶水解技术还具有操作简单、条件温和、产品纯度高等优点。本实验拟采用超微粉碎辅助酶水解技术提取黑豆皮水溶性膳食纤维，以提高水溶性膳食纤维的产率，并对其特性进行研究，为开发具有降血脂功效的食品添加剂提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黑豆皮：苏州市天灵中药饮片有限公司；木瓜蛋白酶：10 U/mg、纤维素酶：50 U/mg，上海源叶生物科技有限公司；α-淀粉酶：37 U/mg，北京奥博星生物技术有限责任公司；胆酸钠：分析纯，上海翊圣生物科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)：分析纯，上海如吉生物科技发展有限公司；抗坏血酸(Vc)、浓硫酸、醋酸、醋酸钠、糠醛、三乙酸、硫酸亚铁、磷酸二氢钠、氯化铁、磷酸氢二钠、铁氰化钾、水杨酸、过氧化氢、无水乙醇等：均为分析纯。

1.2 仪器与设备

HMB-701型超微粉碎机：北京环亚天元机械技术有限公司；HC-200型高速多功能粉碎机：浙江省永康市金穗机械制造厂；RE52-3型旋转蒸发器：上海沪西分析仪器有限公司；UV759型紫外可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；7GL-20M型台式高速冷冻离心机：湖南湘仪实验仪器开发有限公司；SHB-3型循环水式多用真空泵：郑州长城科工贸有限公司；PHS-25型pH计：上海雷磁仪器公司。

1.3 方法

1.3.1 工艺流程 1.3.1.1 黑豆皮粉样品制备

黑豆皮→清洗→干燥→粉碎→过40目筛→黑豆皮粗粉→酶解、灭酶→干燥→黑豆皮粉样品

1.3.1.2 黑豆皮水溶性膳食纤维的提取

黑豆皮粉样品→纤维素酶降解→离心→浓缩→无水乙醇沉淀→离心、分离→干燥→黑豆皮SDF

1.3.2 操作要点

经高速多功能粉碎机过40目筛制备黑豆皮粗粉，向其添加37 U/mg，ɑ-淀粉酶50 μL/g，在65 ℃水浴恒温振荡器中摇荡1 h，灭酶10 min，冷却，再向其添加10 U/mg木瓜蛋白酶100 μL/g[16]，在45 ℃水浴恒温振荡器中摇荡2 h[17]，灭酶10 min，经过滤、烘干至恒重，制备黑豆皮粉样品。

将准确称量的黑豆皮粉样品置于100 mL离心管中，醋酸-醋酸钠缓冲溶液溶解纤维素酶后，在离心管中与样品充分混合并振荡，水浴温度60 ℃条件下提取60 min，沸水浴灭酶10 min并冷却后，于离心机4 000 r/min离心15 min，滤去残渣，取其上清液进行浓缩。之后，用4倍体积的无水乙醇对浓缩液沉淀2 h，离心取沉淀，干燥至恒重，即为黑豆皮水溶性膳食纤维(SDF)。

1.3.3 超微粉碎对提取黑豆皮水溶性膳食纤维的影响

准确称量黑豆皮粗粉置于超微粉碎机中粉碎，制备黑豆皮超微粉，将一次性所制得的超微粉分别过50、100、200、300、400、500目筛，获得不同粒度的超微粉，按照1.3.1.2工艺流程制备黑豆皮水溶性膳食纤维，研究超微粉粒径大小对产率的影响，并在此基础，进一步优化酶法提取黑豆皮水溶性膳食纤维的工艺。

1.3.4 单因素实验

通过预实验，预测较好的参数范围并实施单因素实验，均实施3次平行实验[18]。

(1)液固比：固定酶解温度、酶解时间、酶底比分别为55 ℃、2 h、0.2(U/mg)，考察液固比[10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1(mL/g)]对黑豆皮水溶性膳食纤维产率的影响。

(2)酶底比：固定酶解温度、酶解时间、液固比分别为55 ℃、2 h、30∶1(mL/g)，考察酶底比[0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35(U/mg)]对黑豆皮水溶性膳食纤维产率的影响。

(3)酶解时间：固定酶解温度、酶底比、液固比分别为55 ℃、0.2(U/mg)、30∶1(mL/g)，考察酶解时间(1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h)对黑豆皮水溶性膳食纤维产率的影响。

(4)酶解温度：固定酶解时间、酶底比、液固比分别为2 h、0.2(U/mg)、30∶1(mL/g)，考察酶解温度(40、45、50、55、60、65 ℃)对黑豆皮水溶性膳食纤维产率的影响。

1.3.5 正交实验设计

在单因素实验的基础上，选择对黑豆皮水溶性膳食纤维产率影响相对较大的因素为考察因素，以黑豆皮SDF产率为考察指标，采用Design-Expert 8.05进行处理与分析，得出黑豆皮SDF提取的最佳工艺条件。

1.4 测定指标与方法

1.4.1 黑豆皮SDF产率的计算

将收集到的固体物质置于45 ℃电热鼓风干燥箱中干燥1～2 h，盖好盖子取出，在干燥器内冷却0.5 h后称量。重复操作，直至前后2次的质量差<2 mg，即为恒重，按式(1)计算黑豆皮SDF的产率。

(1)

式中：X为黑豆皮SDF产率/%；m1为黑豆皮水溶性膳食纤维的提取质量/g；m2为黑豆皮粉样品的质量/g。

1.4.2 膨胀性的测定

准确称量1.0 g黑豆皮SDF粉末(m3)于干燥的50 mL量筒中，记录其初始体积V1，然后添加蒸馏水至刻度，搅拌均匀后于室温静置过夜，观察并记录吸水后体积V2，按式(2)计算黑豆皮SDF的膨胀性[19]。

(2)

式中：SWC为黑豆皮SDF膨胀性/mL/g；V1为初始体积/mL；V2为吸水膨胀后的体积/mL；m3为试样质量/g。

1.4.3 持水性的测定

准确称量0.5 g黑豆皮SDF粉末(m4)置于50 mL离心管中，向其添加20 mL蒸馏水，室温下漩涡振荡24 h，3 000 r/min离心15 min，除去上清液并用滤纸吸干残留水分称量后计算为湿重M，按式(3)计算黑豆皮SDF的持水性[20]。

(3)

式中：WHC为黑豆皮SDF持水性/g/g；m4为试样质量/g；M为湿重/g。

1.4.4 持油性的测定

准确称量0.5 g黑豆皮SDF粉末(m5)置于经干燥的50 mL离心管中，向其添加10 mL菜籽油，摇匀浸泡1 h，间隔10 min摇荡一次，在3 000 r/min离心15 min，除去上清液并用滤纸吸干残留油分，称量剩余沉淀重量m6，按式(4)计算黑豆皮SDF的持油性[21]。

(4)

式中：OHC为黑豆皮SDF持油性/%；m5为黑豆皮SDF粉末质量/g；m6为剩余残渣质量/g。

1.4.5 黑豆皮SDF对胆酸钠的体外吸附测定

测定方法参照文献[22]。

1.5 数据处理

数据均用Origin 8.5与Design-Expert 8.05进行处理与分析。

2 结果与分析

2.1 超微粉碎粒径大小对黑豆皮SDF产率的影响

由图1可知，在过50～400目筛(粒径270～25 μm)时，黑豆皮SDF产率随筛网目数的增大而升高。当实验样品过400目筛网而未过500目(粒径25～38 μm)时，黑豆皮SDF产率达12.28%。可能由于经超微粉碎后，颗粒微细化，粉体比表面积增大，进而增大了与溶剂的接触面积[23]，促使黑豆皮SDF的进一步溶出；此外，黑豆皮细胞在强作用力下破碎更加彻底，促使进一步降解细胞壁，增强其亲水性，使黑豆皮SDF可直接溶于溶剂中，不用间接通过细胞膜而缓慢扩散。实验样品过500目筛网(粒径<25 μm)，提取率为12.31%，与过400目筛网相比，产率变化较小，可能由于粒径小的超微粉，增大粉体内部静电摩擦力，减弱其流动性，加强其吸附作用，粉体间易出现黏附和结团现象。综合考虑，选取过400目而未过500目(粒径25～38 μm)的样品开展纤维素酶酶解探究。

图1 不同超微粉粒径对黑豆皮SDF产率的影响

2.2 单因素实验结果

由图2可知，当液固比在[10∶1～30∶1(mL/g)]时，黑豆皮SDF产率随液固比的升高而呈现增加的趋势。推测可能是液固比例越大，使粉体颗粒与溶剂接触更加充分，有助于黑豆皮SDF的溶出；提取液中黑豆皮SDF质量浓度越低，体系中传质推动力就越大，进而提升了提取速率。当液固比大于30∶1(mL/g)时，黑豆皮SDF产率随液固比增大而呈现平缓趋势；另外，过高的液固比不仅造成原料的浪费，还会增加后期处理的难度。综合考虑，选取30∶1(mL/g)为适宜液固比。

图2 四因素对黑豆皮SDF产率的影响

由图2可知，当酶底比在0.10～0.20(U/mg)时，黑豆皮SDF产率随纤维素酶添加量的增加而增大，当酶底比大于0.20(U/mg)时，黑豆皮SDF产率呈现下降趋势。可能是由于适量纤维素酶作用下，促使黑豆皮SDF不断溶出；与此同时，部分水不溶性膳食纤维发生降解，分子链断裂，分子量降低，有助于水不溶性膳食纤维(IDF)转变为水溶性膳食纤维(SDF)；而纤维素酶添加量过多，能促使水不溶性膳食纤维降解为较低分子量的低聚糖、多糖等，因其分子量过小而不能被乙醇沉淀，进而降低黑豆皮SDF产率。综合分析，选取0.20 U/mg为适宜的酶底比。

由图2可知，当酶解时间在1～2 h时，随酶解时间推移，黑豆皮SDF产率呈增加的趋势；当酶解时间大于2 h时，SDF产率呈下降的趋势。可能由于在纤维素酶作用下，充分水解，进而提高了黑豆皮SDF产率；但随着酶解时间的推移，纤维素酶作用有限，提取量接近饱和；另外，酶解时间越长，SDF所含果胶、部分半纤维素等物质易发生降解现象[24]。综合考虑，选取2 h为适宜的酶解时间。

由图2可知，黑豆皮SDF产率随酶解温度的升高而呈先上升后下降的趋势，在55 ℃时，产率达最大值。由于酶活性受温度影响很大，过低温度能减弱酶促反应，而升高温度可提高酶促反应速度。在55 ℃时，纤维素酶活性最强，酶促反应速度最大。过高的酶解温度不仅降低酶的活性，还会增大原料提取液黏度，进而降低黑豆皮SDF产率。综合考虑，选取55 ℃为适宜的酶解温度。

2.3 响应面实验结果

2.3.1 响应面法优化SDF提取条件的实验设计

在单因素实验结果基础上，以液固比(X1)、酶底比(X2)、酶解温度(X3)为实验因素，以黑豆皮SDF产率(Y)为考察指标，设计三因素五水平的二次通用旋转组合实验，对黑豆皮SDF的提取工艺进行优化，实验因子及其水平见表1。

表1 三元二次通用旋转组合设计实验因素水平编码表

2.3.2 响应面实验设计与实验结果

综合分析各实验因素对黑豆皮SDF产率的影响，以产率为主要指标，采用二次通用旋转组合实验设计，进行响应面分析。其实验组合及结果见表2。

表2 三元二次通用旋转组合设计实验结果

经回归拟合后，得到二次多项式回归方程为：

Y=12.01+1.32X1+1.60X2-0.83X3-0.97X1X2-0.43X1X3-0.54X2X3-0.56X21-1.22X22-0.93X23

(5)

2.3.3 黑豆皮SDF产率方差分析表及响应曲面分析

由表3可知，二次回归模型(P=0.000 1<0.01)影响显著，且失拟项(P=0.891 4>0.05)影响不显著，回归系数R2=0.928 0，表明该回归模型与实际测量值拟合效果良好，可使用多项回归方程代替实验点对实验结果进行分析。一次项X1、X2、X3，二次项X22、X23对实验结果影响特别显著，二次项X21与交互项X1X2对实验结果影响显著，交互项X1X3、X2X3对实验结果的影响均为不显著。综合考虑，酶底比、液固比、酶解温度对实验结果的影响均显著，3个因素对实验结果影响的主次依次为酶底比>液固比>酶解温度。

表3 黑豆皮SDF产率方差分析表

2.3.4 优化与验证

根据优化结果可知，黑豆皮SDF提取最优工艺条件：液固比30.41∶1(mL/g)、酶底比187.81(U/mg)、温度60.46 ℃，产率为12.98%。考虑实际操作的可行性，将最优的黑豆皮SDF提取条件修改为：液固比30∶1(mL/g)、酶底比188(U/mg)、温度60 ℃，根据修正的最佳提取条件，实施3次重复验证实验，得到黑豆皮SDF平均产率为12.01%，与理论值之差<5%，表明所得模型参数准确可靠。

2.4 持水力、持油力和膨胀力的测定

由表4可知，黑豆皮SDF的膨胀力、持水力、持油力分别为：2.56(mL/g)、377%、138%。李梦琴等[25]采用超高压处理小麦麸皮并提取水溶性膳食纤维(SDF)，测其膨胀力、持水力分别为1.49(mL/g)、308%；鞠健等[26]以山药皮为原料制备水溶性膳食纤维(SDF)，测其持油性为1.30(g/g)，表明本实验制备的黑豆皮SDF具备良好的膨胀力、持水力和持油力。具有较高的持水力、持油力、膨胀力的水溶性膳食纤维可使人产生一定的饱腹感，降低食欲，进一步控制肥胖，同时可刺激肠道蠕动，能及时将粪便中的有害物质排出体外，进而降低肠道癌、痔疮等患病风险。因此，黑豆皮SDF可在食品加工中用作食品添加剂。

表4 黑豆皮SDF膨胀力、持水力和持油力的测定

2.5 胆酸钠的体外吸附分析

膳食纤维的降血脂功效可用其对胆酸钠的吸附能力进行衡量，胆固醇分解产物含胆酸盐，通过借助疏水相互作用、范德华力及氢键等与胆酸盐发生相互作用，或以一种作用力为主，束缚体内胆酸盐及促使排出体外，使其在肠肝循环过程中降低体内胆酸盐的积累量，胆固醇代谢得以改善，进而可降低体内胆固醇含量，间接发挥降血脂的功能特性[27]。由图3可知，SDF溶液中胆酸钠的浓度在伴随时间的延长而降低，在最开始的30 min内，浓度变化比较显著，而后趋于平缓，并趋向一个定值。可能是由于SDF含量有限，其对胆酸钠的吸附量伴随时间的延长，逐渐达到饱和状态，在105 min时，测其胆酸钠质量浓度1.402 2 g/L，清除量0.597 8 g/L，计算黑豆皮SDF对胆酸钠吸附率为29.89%。

图3 胆酸钠随时间变化的吸光度值

3 结论

利用超微粉碎辅助酶水解技术提取黑豆皮水溶性膳食纤维，并采用二次通用旋转组合设计优化提取条件，各因素对产率的影响为：酶底比>液固比>酶解温度。制备黑豆皮SDF最优工艺为：物料粒径25～38 μm、液固比30∶1(mL/g)、酶底比188(U/mg)、温度60 ℃、酶解2 h。该条件下，SDF平均产率为12.01%，膨胀力2.56(mL/g)，持水力377%，持油力138%，对胆酸钠的吸附率达29.89%，具备一定的降血脂功效，但对制备的黑豆皮SDF分离纯化及其生理功能还需进一步的研究。