米发糕的体外模拟胃肠消化特性研究

陈 晨 贾才华 赵思明 格桑卓玛 张宾佳牛 猛 熊善柏 林亲录

(华中农业大学食品科学技术学院1，武汉 430070)(中南林业科技大学食品科学与工程学院2，长沙 410004)

食品中的多糖、蛋白质等大分子物质在人体内不可被直接消化，然而经体内酶、pH等作用，可降解为小肽、游离氨基酸、单糖等易被消化吸收的物质[1]。食物胃肠消化物的营养成分可作为膳食营养评价的重要手段。米发糕经胃肠消化后，产生小分子活性肽、低聚糖等成分，易被肠道消化吸收而直接在机体内起作用。经不同菌种发酵后，由于微生物产生的酶对米发糕营养物质的作用位点不同，使得其营养成分如肽和糖的组成和结构有差异，导致其生物活性不同[2]。消化使米发糕蛋白质得到充分的降解，在胃肠消化物中暴露出更多具有抗氧化作用的基团[3]。组氨酸、某些酸性氨基酸侧链和多糖结构中的醇羟基[4]均可以与产生·OH等自由基所必需的金属离子(如 Fe2+、Cu2+等)络合，具有抗氧化作用；Trp和Tyr等具有供氢能力的氨基酸可将氢原子给予自由基，导致自由基链反应减慢或终止，从而起到抗氧化的作用[5]。

本实验以实验室前期研发的专用菌株，以不同组合的发酵剂，发酵制作米发糕，研究发酵剂对米发糕胃肠消化物及活性的影响，探索产生抗氧化活性的机理，确定具有高抗氧化活性的发酵剂。为传统米发糕的营养特性进行科学评价提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

大米粉(粉状)，由岗优118型籼米浸泡磨粉制成，收获于2015年：黄冈东坡粮油集团；羟丙基二淀粉(粉状)：杭州普罗星变性淀粉有限公司；马铃薯预糊化淀粉(粉状)：北京远大食品添加剂有限公司；白砂糖(颗粒状)：市售；安琪耐高糖活性干酵母和甜酒曲(甜味型)：宜昌安琪酵母股份有限公司；ZSM-001卡斯特酒香酵母[6]、ZSM-002植物乳杆菌[7]、ZSM-003米根霉[8]，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，于2016年取出，菌株均为冻干菌粉，用前需在固体培养基中活化，并在液体培养基中扩大培养，获得菌泥作为米发糕发酵剂。

1.2 主要试剂

盐酸，氢氧化钠、3，5-二硝基水杨酸、葡萄糖、菲咯嗪、邻二氮菲、乙醇：国产分析纯；DPPH，胃蛋白酶，胰酶，抗坏血酸：sigma公司。

1.3 主要仪器与设备

TDL-5A型离心机：上海菲恰尔分析仪器有限公司；HBSHP-150型生化培养箱：上海精宏实验设备有限公司；722S 型可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司。

1.4 方法

1.4.1 米发糕的制作

以大米粉、发酵剂(分别为ZSM-001、ZSM-001与ZSM-002、ZSM-001与ZSM-003、安琪酵母与酒曲)、白砂糖、水等为原料，搅拌均匀，于35 ℃发酵12 h后，注模蒸制而成。

1.4.2 米发糕水解液的制备1.4.2.1 水提液制备

米发糕捣碎加入去离子水(1∶5)，37 ℃摇床4 h后置于沸水浴中10 min，快速冷却。离心(4 000 r/min，20 min)，过滤，取上清液。

1.4.2.2 体外模拟胃消化过程

米发糕捣碎加入去离子水(1∶5)，用1.0 mol/L盐酸调节pH至2.0，加入胃蛋白酶(米发糕蛋白质量的4%)，37 ℃摇床恒温消化2 h。2 h后取样，pH值迅速调为7.0，置于沸水浴中10 min灭酶，快速冷却。离心(4 000 r/min，20 min)，取上清液。

1.4.2.3 体外模拟胃肠消化过程

米发糕经过胃消化道酶系消化2 h后，用1.0 mol/L氢氧化钠调pH值至7.5。然后加入胰酶(加量为米发糕蛋白质量的4%)，在37 ℃摇床恒温消化2 h。pH值迅速调为7.0，置于沸水浴中10 min 灭酶，快速冷却，离心(4 000 r/min，20 min)，取上清液。

1.4.3 米发糕水解物成分测定1.4.3.1 可溶性蛋白质含量的测定

取5 mL米发糕水解液，至50 mL离心管，加入少许蒸馏水，均质后定容至40 mL，4 000 r/min 离心10 min，取上清液用Folin-酚试剂法进行测定。

1.4.3.2 可溶性肽含量的测定

用双缩脲比色法测定米发糕水解液的肽含量[9]。

1.4.3.3 游离氨基酸含量的测定

取液体样品5～10 mL，加50 mL蒸馏水和5 g左右活性炭，加热煮沸并过滤，用热水洗涤活性炭，收集滤液于100 mL容量瓶中。吸取样品溶液1～4 mL于50 mL比色管中，加pH 5.4乙酸和乙酸钠缓冲液和2%茚三酮溶液各1 mL，加0.1 mL抗坏血酸，沸水浴15 min，室温静置15 min之后，在570 nm下检测吸光值[10]。

1.4.3.4 总糖含量的测定

吸取一定量的样品于100 mL锥形瓶中，加5.0 mL 50% HCl，混匀，于70 ℃水浴锅中水解15 min，冷却，调pH为7，定容100 mL。吸取样品水解液1 mL于25 mL比色管中，按照3,5-二硝基水杨酸法测定还原糖含量[11]。

总糖=(还原糖质量×稀释倍数×100)/样品体积×100%

1.4.4 米发糕水解物的抗氧化活性的测定1.4.4.1 DPPH自由基清除能力

取1.5 mL样品溶液，加入1.5 mL 99.5%的乙醇和0.675 mL的0.02%DPPH乙醇溶液混合，振荡混匀，室温下避光水浴30 min，然后在517 nm下检测体系吸光值。吸光值越低，体系的清除DPPH·能力越强。空白即是将1.5 mL样品溶液换成1.5 mL去离子水[12]。

清除DPPH·能力=[(空白吸光值-样品吸光值 )/空白吸光值]×100%

1.4.4.2 OH自由基清除能力

取1.0 mL样品溶液，加入1.0 mL 0.75 mmol/L邻二氮菲和 2.0 mL pH 7.4 磷酸盐缓冲液，加入1.0 mL 0.75 mmol/L FeSO4，混合均匀，加入 1.0 mL 0.12% H2O2，37 ℃水浴保温 60 min，蒸馏水调零测定 536 nm处吸光值。

羟自由基清除率= (AS-AP)/AB×100%

式中： AS为样品吸光值；AP为1.0 mL 蒸馏水代替样品，其他反应条件相同；AB为用 2.0 mL 蒸馏水代替样品和 0.12% H2O2。

1.4.4.3 亚铁离子螯合力的测定

取1 mL的样品溶液，加入3.7 mL乙醇和0.1 mL 2 mmol/L的FeCl2溶液混合，再加入0.2 mL 5 mmol/L的菲咯嗪溶液启动反应。室温静置10 min后，在562 nm波长处检测吸光度。

亚铁离子螯合能力=[(空白吸光值-样品吸光值)/空白吸光值]×100%

1.4.4.4 还原能力的测定

取多肽溶液1 mL，加入0.2 mol/L的磷酸盐缓冲液(pH 6.6)2.5 mL和1%的铁氰化钾溶液2.5 mL，充分混和以后，在 50 ℃下，保温 20 min后加入2.5 mL 10%的三氯乙酸。经充分混合后以3 000r/min离心10 min。取上清液2.5 mL，加入去离子水2.5 mL和0.1% FeCl30.5 mL，混匀后，测定反应液在700 nm处的吸光度值。

1.5 数据统计分析

所有数据采用Excel2013 与SAS9.2、SPSS22.0软件进行处理和分析。其中显著性分析采用SPSS处理，P<0.05判定为变化显著；相关性分析用SAS处理；所有图表均由Excel处理。

2 结果与分析

2.1 米发糕胃肠消化物的营养成分

2.1.1 米发糕胃肠消化物中可溶性蛋白质含量

米发糕水解液在不同消化阶段的可溶性蛋白质含量见图1。其中，水提液的可溶性蛋白质含量最低，其中JR的可溶性蛋白质含量最高，其次为J、JG、AJ。这是由于乳酸菌对米发糕蛋白质的降解作用强于酵母菌和根霉菌[13]。乳酸菌在短期内迅速繁殖，所产蛋白酶和酸可促使部分蛋白分解和溶出，其所产乳酸是具有α-羟基结构的羧酸，能与多肽链上的基团形成氢键，也会促进蛋白的溶出[14]。胃消化阶段，在胃蛋白酶和酸的作用下，米发糕蛋白质降解，水解为可溶性蛋白和小肽等，消化物中可溶性蛋白质含量相比水提液均有显著增长，以JR蛋白质含量最高。在胃肠消化后，J和JR的蛋白质含量略有下降，而JG和AJ的蛋白含量增加。

注：大写字母表示同一消化阶段不同种类米发糕间有差异，小写字母表示同种米发糕不同消化阶段间有差异(P<0.05)。J为酵母菌发酵制作的米发糕，JR为酵母菌和乳酸菌发酵制作的米发糕，JG为酵母菌和米根霉发酵制作的米发糕，AJ为安琪酵母和甜酒曲发酵制作的米发糕。余同。图1 米发糕水解液中可溶性蛋白质含量

2.1.2 米发糕胃肠消化物中可溶性肽含量

发酵过程微生物代谢产生的蛋白酶系和酸促使体系中蛋白质降解，产生小分子多肽。由图2知，米发糕水提液的肽含量与蛋白质含量相比较高，以J的肽含量最高，经过胃消化，胃蛋白酶和酸性条件使蛋白质进一步降解，JR、JG、AJ肽含量相比水提液显著增加，以JR的肽含量最高。胃肠消化阶段，胰酶中的胰蛋白酶继续降解蛋白，J、JG、AJ米发糕肽含量与胃消化阶段比显著增加，而JR米发糕肽含量降低，可能是由于胰酶作用，小分子多肽继续降解成氨基酸导致[15]。

图2 米发糕水解液中可溶性肽含量

2.1.3 米发糕胃肠消化物中游离氨基酸含量

由图3可以看出，J、JR、JG、AJ水提液的游离氨基酸含量较低，经过胃消化，游离氨基酸含量均显著增加，以JR的游离氨基酸含量最高，其次为AJ、JG、J。在胃肠消化阶段，游离氨基酸含量大幅度增加，以AJ的氨基酸含量最高，其次为JR。米发糕水提液中的游离氨基酸主要来自于发酵过程中，微生物代谢产生的蛋白酶对大分子蛋白和肽类物质的降解[16]，含量较低。在胃部消化过程中游离氨基酸的释放较少，而在肠道消化过程中释放了大量游离氨基酸，说明胰酶对多肽的降解作用较强。

图3 米发糕水解液中游离氨基酸含量

2.1.4 米发糕胃肠消化物中可溶性总糖含量

由图4可知，水提组和胃消化组的四种米发糕可溶性总糖含量差异不显著，而在胃肠消化阶段，J、JR、JG、AJ可溶性总糖含量均显著升高且具有显著性差异，其中AJ总糖含量最高，其次为JR、J、JG。由于胃蛋白酶和酸对淀粉降解作用不明显，而胰酶中含有胰淀粉酶，对米发糕中的淀粉有酶解作用，使得从淀粉上脱落下的单糖、二糖等含量增多，使得水解液中可溶性总糖含量大幅度提高[17]。

图4 米发糕水解液中可溶性总糖含量

2.2 米发糕胃肠消化物的抗氧化活性

2.2.1 DPPH自由基清除能力

不同浓度VC溶液以及四种米发糕水解液的DPPH·清除能力如图5所示。米发糕水解液的DPPH·清除能力与0.006～0.01 mg/mL VC溶液相当。J、JR、AJ在水提组、胃消化组、胃肠消化组的DPPH·清除能力变化规律相似，且差异不显著。其中，AJ的DPPH·清除率清除最低。水提液组，JR的DPPH·清除率最高(42.7%)；胃、胃肠消化消化组中JG的清除能力均最高，表明酵母菌和根霉菌制作的米发糕能够在胃肠消化液暴露出较多的供氢基团，与自由基作用，表现出较强的自由基清除能力[18]。

图5 米发糕水解液的DPPH自由基清率

2.2.2 羟基自由基清除能力

不同浓度VC溶液以及四种米发糕水解液的·OH清除能力如图6所示。米发糕水解液的·OH清除能力与0.01～0.04 mg/mL VC溶液相当。水提液组，JR清除·OH的能力最强；经过胃蛋白酶消化后，J、JR、JG、AJ的·OH清除率均显著提高，分别提高到29.40%、32.19%、25.36%、31.47%；进一步用胰酶消化后，JG和AJ清除·OH的能力仍在进一步的提升，但J、JR的清除率有所下降，清除率最高的为JR。表明酵母菌和乳酸菌制作的米发糕水解物富含供氢体，可清除或抑制自由基[19]。

图6 米发糕水解液的羟自由基清除率

2.2.3 亚铁离子螯合能力

如图7所示，米发糕水解液的Fe2+鳌合能力与0.001～0.006 mg/mL EDTA溶液相当。水提组中，AJ的Fe2+鳌合能力最强，其次是JG、JR、J。胃消化后，Fe2+鳌合能力均增强，其中最高的是JR，其次为JG。胃肠消化后，JR、JG、AJ鳌合Fe2+的能力升高，而J降低。其中，Fe2+鳌合能力最强的是AJ，其次为JR。蛋白质的酸性氨基酸侧链羧基、多糖的酚羟基、组氨酸等可以与Fe2+形成螯合物，减少机体自由基的产生[20]。表明安琪酒曲和酵母粉、酵母菌和乳酸菌复合制作的米发糕的胃肠水解物中这些活性物质较多。

图7 四种米发糕水解液的Fe2+鳌合能力

2.2.4 还原能力

反应体系在700 nm处吸光度越大，说明样液还原能力越强[21]。如图8所示，米发糕水解液的还原能力接近于0.01～0.06 mg/mL VC溶液的还原能力。水提组中，JR还原能力最高，其次为JG；经胃消化后，还原能力均显著增加，其中JR还原能力最强，其次为JG、AJ；经胃肠消化后，J、JR还原能力下降，而JG、AJ的还原能力略有升高。其中，JG还原能力最高。发酵时微生物所分泌的各种酶类物质如蛋白酶、糖化酶，加上消化过程，胃蛋白酶和胰酶的作用，使样品产生更多的还原糖、小肽和氨基酸等物质，使样品还原能力有不同程度的提高[22]。

图8 四种米发糕水解液的还原能力

2.3 米发糕胃肠水解物成分和抗氧化活性的相关性

米发糕水提和胃肠消化过程中的蛋白质、多肽、氨基酸、总糖含量与抗氧化活性的相关性如表2所示，·OH清除能力与蛋白质和肽含量呈极显著正相关关系，与游离氨基酸含量有正相关性，与总糖相关性不大。Fe2+螯合能力与蛋白质、游离氨基酸、总糖含量显著正相关，与肽含量有正相关性。还原能力与蛋白质含量极显著相关，与肽含量正相关；DPPH·清除能力与蛋白质、多肽、氨基酸、总糖含量相关性不大。结果表明，米发糕胃肠水解物中的可溶性蛋白质和可溶性肽对清除·OH作用最强[23]，游离氨基酸和可溶性总糖对螯合Fe2作用最强，其对清除DPPH自由基作用均不显著[24]。

表1 米发糕胃肠水解物成分与抗氧化活性的相关性分析

注：*表示有相关性0.05

3 结论

微生物发酵和胃肠道消化有利于大分子物质降解，促进易于人体吸收的小分子活性物质产生。米发糕胃肠消化物中的水溶性蛋白、肽、游离氨基酸、可溶性糖对·OH清除能力、Fe2+螯合能力、还原能力有不同程度的提高，而对DPPH·的清除作用不大。胃肠水解物中，以水溶性蛋白含量较高时，·OH清除能力、还原能力作用最强，水溶性糖含量较高时，Fe2+螯合能力最强。分子质量较大的蛋白水解物的抗氧化作用较强。采用酵母菌和乳酸菌、酵母菌和米根霉作为发酵剂，可制得抗氧化活性较高的米发糕。