马齿苋不同溶剂提取物对核桃油的抗氧化动力学研究

陈 凌 骆卢佳 曹巧巧 贺伟强

(嘉兴职业技术学院农业与环境分院，嘉兴 314036)

核桃油味美醇香、营养丰富, 含亚油酸64.6%、油酸16.3%、α-亚麻酸15.8%[1]、棕榈酸5.6%、硬脂酸2.2% , 其中不饱和脂肪酸达91.4%[2-3]，必需脂肪酸(EFA) 质量分数达75.8%[4]，并且含有多种生物活性物质；能够降低血脂、预防心脑血管疾病、抗癌防癌、改善记忆、清除自由基[5-6]。在经济发达的国家视核桃油为保健专用油, 近年在国际食用油市场上价格达10 000～12 000 美元/t, 且供不应求。但由于核桃油富含不饱和脂肪酸, 在加工、储藏及销售过程中极易发生氧化酸败变质，因此其保藏就显得尤为重要。目前，食品工业主要使用丁基羟基茴香醚(BHA)、叔丁基对苯二酚(TBHQ)、二丁基羟基甲苯(BHT)和没食子酸丙醋(PG) 等人工合成抗氧化剂。大量实验研究表明，它们有一定的毒性和致癌作用，因此越来越多的国家已停止或严格限制使用合成抗氧化剂。马齿苋抗氧化活性的研究主要侧重于对人体的抗衰老、预防某些疾病等方面，在核桃油抗氧化的应用还鲜见报道。因此，用药食两用植物马齿苋提取抗氧化成分，研究其活性成分对核桃油的抗氧化作用，为延长核桃油的货架期和开发出新型保健食用油提供借鉴。本实验采用烘箱法，将不同溶剂提取的马齿苋活性成分添加于核桃油中，通过测定不同时间的过氧化值以确定马齿苋提取物在核桃油中的抗氧化活性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

野生马齿苋采于嘉兴职业技术学院校园内，核桃油市场购置新鲜压榨。95%酒精、葡萄糖、浓硫酸、苯酚、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、碳酸氢钠均为分析纯，维生素E软胶囊[每粒含维生素E(天然型)100 mg，辅料为明胶、甘油、精致玉米油]：浙江医药股份有限公司新昌制药厂；芦丁、没食子酸：国药集团化学试剂有限公司；Folin-Ciocalteu试剂：上海荔达生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

T6紫外分光光度计；JP-500B-2多功能粉碎机；RE-52C旋转蒸发仪；KQ-100B超声波清洗器；202-2A数显电热恒温干燥箱；FD-4冷冻干燥机；Millipore超纯水仪。

1.3 方法

1.3.1 马齿苋活性成分的提取

新鲜马齿苋洗净、100 ℃杀青5 min 后70 ℃恒温干燥，取出后粉碎，石油醚脱脂。脱脂马齿苋粉用不同溶剂超声波辅助提取其活性成分，提取工艺见图1。将滤液真空浓缩后冷冻干燥，制成固体待用。

1.3.2 马齿苋活性成分含量测定

1.3.2.1 多糖含量的测定。采用苯酚一硫酸法[7]，以葡萄糖作为标准品，绘制标准曲线，求出回归方程(y=0.010 8x+0.002，R2=0.998 9)。将测得的提取液的光吸收值代入回归方程，求出样品的多糖含量。

1.3.2.2 酚类含量的测定。采用Folin-Ciocalteu 方法，以没食子酸为标准品，比色法测定其总酚的含量。

标准曲线的制作：用超纯水溶解0.2 g没食子酸, 定容至100 mL, 准确移取1 mL稀释到100 mL，得0.02 mg/mL没食子酸溶液。分别移取0、1、2、3、4、5、6 mL 没食子酸标准溶液，到10 mL 比色管中，加入Folin-Ciocalteu 试剂1.0 mL，混匀，3 min后加入20 g/100 mL Na2CO3溶液3 mL，用超纯水定容, 置于30 ℃的恒温水浴锅中90 min, 显色后于765 nm波长下测定吸光度，以超纯水代替样品为空白，以吸光度为纵坐标，没食子酸溶液质量浓度为横坐标绘制标准曲线，求出回归方程(y=2.106 4x+0.064 4，R2=0.998 3)。

样品中总酚含量的测定：取提取液1 mL稀释到100 mL，再酌情稀释，测吸光度。将其吸光度代入回归方程计算马齿苋提取物中总酚的含量。

1.3.2.3 黄酮含量的测定。采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法，以芦丁为对照品，分光光度计测定马齿苋黄酮的含量[8]。绘制芦丁浓度与吸光度(A)的关系曲线，以吸光值对浓度进行线性回归分析，求得回归方程为(y=11.654x-0.006 1，R2=0.999 6)。将测得的提取液的吸光度值代入回归方程，得到样品黄酮含量。

图1 马齿苋活性成分的提取工艺流程

1.3.3 抗氧化性能实验

采用Schaal烘箱法，称30 g 油脂5份置于锥形瓶中，1份为空白对照，3份分别按油重的0.01%、0.02%、0.03%添加马齿苋活性成分(均为固体直接添加到核桃油中，除了多糖微溶外，其他提取物都溶于核桃油)，另1份按油重的0.02%添加维生素E胶囊里的液体为对比。混合均匀，置于(50±1)℃的恒温烘箱中，每隔24 h 搅拌并检测核桃油的过氧化物值(POV)。

1.3.4 过氧化值的测定

过氧化值按国家标准GB/T 5538—2005 的方法测定。

2 结果和分析

2.1 不同溶剂提取马齿苋活性成分的含量

用1.3.2方法测得的马齿苋不同溶剂浸提物中活性成分(主要是黄酮、酚类和多糖)的含量见表1。3种溶剂提取物中多糖含量最高的是水提物，酚类含量最高的是丙酮提取物，黄酮含量最高的也是丙酮提取物。醇提物和丙酮提取物3种活性成分的总质量分数超过100%，这是由于一些酚类本身就是黄酮，有重复计算。水提物中3种活性成分的总质量分数不到100%，说明除了这3种成分之外的其他成分含量较多。

表1 马齿苋不同溶剂提取物中活性成分的含量

2.2 多糖对核桃油的抗氧化性能

从图2看出， 在(50±1)℃，所试浓度范围内，马齿苋多糖对核桃油都有较好的抗氧化性， 抗氧化性活性为：0.02%>0.01%>0.04%，0.01%和0.02%的马齿苋多糖对核桃油的抗氧化性均比0.02%VE强，8 d后添加0.01%的马齿苋多糖的核桃油的POV值为0.874 mmol/kg(此时空白对照值为5.172 mmol/kg)，是空白值的16.9%；添加0.02%多糖的POV为0.822 mmol/kg，是空白值的15.9%；添加0.04%多糖的POV为1.630 mmol/kg，是空白值的35.7%；添加0.02%VE的 POV为1.071 mmol/kg，是空白值的20.7%。

多糖是由10个以上多种单糖聚合而成的天然高分子物质，多糖类化合物具有清除自由基、抑制脂质过氧化作用、抑制亚油酸氧化等抗氧化作用[9]。多糖对抑制脂质过氧化的途径主要有两种：第一种为多糖结构中的醇羟基与铜、铁等金属离子络合，抑制羟基自由基的产生，影响脂质过氧化的进行，从而抑制活性氧的产生；第二种为多糖分子直接捕获制止过氧化链式反应中产生的活性氧，阻止或减慢脂质过氧化的顺利进行[10]。在所试条件下马齿苋不同溶剂提取物中0.02%马齿苋多糖对核桃油抗氧化性最好，其次为0.01%马齿苋多糖，0.03%马齿苋多糖对核桃油的抗氧化性较差，可能是浓度高时，互相之间形成氢键，其抗氧化活性位置羟基减少而降低抗氧化活性。

图2 不同浓度马齿苋多糖对核桃油的抗氧化活性

2.3 马齿苋乙醇提物对核桃油的抗氧化性能

从图3得知，0.01%和0.02%的马齿苋醇提物对核桃油的抗氧化性都比0.02%VE强，抗氧化性为：0.01%>0.02%>0.03%，说明马齿苋醇提物对核桃油的抗氧化性与马齿苋醇提物的添加量呈负相关性。在(50±1)℃恒温8 d后添加0.01%的马齿苋醇提物的核桃油的POV值是空白值的19.1%，0.02%的POV值是空白值的20.6%，最差的是添加0.03%马齿苋醇提物，其POV值为3.794 mmol/kg，是空白值的86.5%。

图3 不同浓度马齿苋乙醇提取物对核桃油的抗氧化活性

醇提物中含量最高的活性成分是酚类，酚类物质结构中具有化学性质较活泼的羟基氢，可以提供氢，可与脂肪在自动氧化反应中产生的游离基结合，中断脂肪自动氧化的链式反应[11]；失去氢的氧原子上未成对电子能与苯环上的π电子云发生共轭效应，这样，酚自由基的能量就有所降低，不再引发链式反应，从而达到抑制脂质过氧化的目的。低浓度(0.01%～0.02%)时醇提物的抗氧化性较强，但质量分数为0.03%时对核桃油的抗氧化性是所试物的浓度范围内最差的，这是因为植物多酚在适宜浓度范围内具有较强的抗氧化能力，但高于一定浓度后，其清除自由基能力下降，而促氧化作用逐渐增强[12]。

2.4 马齿苋丙酮提物对核桃油的抗氧化性能

由图4可知，在(50±1)℃，所试浓度范围内，马齿苋丙酮提取物对核桃油的抗氧化性都比0.02%VE差，而且随着添加量的增加对核桃油的抗氧化性减弱，8 d后添加0.01%、0.02%、0.03%的马齿苋丙酮提取物的核桃油的POV值分别是空白值的25.5%、52.7%和78.8%，添加0.02%VE的抗氧化性是空白值的20.7%。

图4 不同浓度马齿苋丙酮提取物对核桃油的抗氧化活性

黄酮类化合物可作为自由基受体及链终止剂，过渡金属离子(如Fe2+、Cu2+等)是自由基产生的催化剂，黄酮类化合物具有4-酮基，5-羟基的分子结构，且B 环3′和4′位的连位羟基含有孤对电子[12]，因而能螯合金属离子使其失去催化作用。马齿苋丙酮提取物中黄酮和酚类含量是这3种溶剂提取物中最高的，同时活性成分(多糖、酚类和黄酮的总和)含量也是三者中最高的，但它对核桃油的抗氧化性与其他3种相比却较差，因为高浓度时黄酮类物质往往与糖缩合成“苷”，形成“苷”会明显降低抗氧化能力[14],高浓度时黄酮和酚类不具有抗氧化作用甚至表现促氧化特性[15-17]。

2.5 马齿苋水提物对核桃油的抗氧化性能

由图5可知，在所试条件下马齿苋水提物对核桃油都有较好的抗氧化性，添加量为0.01%和0.02%的比0.02%VE强，马齿苋水提物对核桃油的抗氧化性为：0.01%>0.02%>0.03%，说明马齿苋水提物对油脂的抗氧化性与马齿苋水提物的添加量呈负相关性。8 d后添加0.01%、0.02%、0.03%的马齿苋水提物的核桃油的POV值分别是空白值的19.5%、21.3%、24.7%。

图5 不同浓度马齿苋水提物对核桃油的抗氧化活性

马齿苋水提物对核桃油的抗氧化效果仅次于多糖，水提物中多糖的含量为3种溶剂提取物中最高，酚类和黄酮的含量最低，且多糖、酚类和黄酮的含量最接近(见表1)，可能还与低浓度时多糖和黄酮具有协同效应有关[18]，使得马齿苋水提物、醇提物和丙酮提取物对核桃油的抗氧化性都随着浓度的增加而减弱。

2.6 一级反应速率常数

根据图2～图5中的曲线，求出每条曲线的回归方程y=kt+b(其中y为过氧化物值、k为一级反应速率常数、t为时间、b为截距)，R2为相关系数[19]，见表2。由R2值看出，马齿苋不同溶剂提取物对核桃油的氧化性的拟一阶速率常数与浓度与浓度间的线性关系均良好。速率常数k越大氧化速率越快，抗氧化效果越差。从表2得出马齿苋提取物的抗氧化效果为：0.02%多糖>0.01%多糖>0.01%水提物>0.01%丙酮提取物>0.02%水提物>0.03%水提物>0.02%VE>0.01%醇提物>0.03%多糖>0.02%醇提物>0.02%丙酮提取物>0.03%丙酮提取物>0.03%醇提物。

表2 不同质量浓度马齿苋提取物对核桃油的抗氧化动力学特性

注：时间为1～8 d。

3 结论

在所试浓度范围内，(50±1)℃，1～8 d的核桃油抗氧化实验中，马齿苋多糖、马齿苋水提物、马齿苋醇提物和马齿苋丙酮提取物对核桃油都具有抗氧化性。总体来看马齿苋多糖对核桃油的抗氧化性最好，其次是马齿苋水提物，再其次是醇提物，最差的是马齿苋丙酮提取物。0.01%～0.03%水提物、0.01%～0.02%多糖和0.01%乙醇提取物对核桃油的抗氧化性都优于VE。除马齿苋多糖外，马齿苋水提物、醇提物和丙酮提取物对核桃油的抗氧化性都随着浓度的增加而减弱。