2型猪链球菌的毒力因子的鉴定及分布

徐引弟，王治方，张青娴，朱文豪，焦文强，李海利，郎利敏，王克领

（河南省农业科学院畜牧兽医研究所，郑州450002）

猪链球菌（Streptococcus suis，S.suis）是一种重要的细菌性猪病病原，给全球的养猪业造成巨大损失。当感染S.suis后，病猪通常会出现脑膜炎、关节炎，心内膜炎以及败血症等症状，严重时常引起病猪死亡[1-4]。根据链球菌荚膜多糖抗原性的不同，可分为35个血清型（1～34型和 1/2 型），其中猪链球菌血清型 2 型（Streptococcus suis serotype2，SS2）在世界范围内被广泛报道为最主要的致病性血清型。国内外研究认为猪链球菌的致病性与其毒力因子有密切关系，目前研究较多的猪链球菌主要毒力因子有荚膜多糖（capsular polysaccharide，CPS）、溶菌酶释放蛋白（muramidase-released protein，MRP）、胞外因子（extracellular protein fateror，EPF）和溶血素（suilysin，SLY）。荚膜多糖的成分和结构与细菌的病原性和血清型有关，是致病性分离株所必需的组分。溶菌酶释放蛋白分子质量为136 kDa，是猪链球菌细胞壁上的大分子糖蛋白。溶菌酶释放蛋白单独足以破坏大脑的血管内皮细胞屏障。溶血素通过对机体血小板和淋巴细胞的损伤来破坏机体的凝血系统和免疫系统，溶血素阳性的链球菌可以破坏脉络丛上皮细胞，从而突破脑脊液屏障，出现脑膜炎症状[5-8]。链球菌的毒力是由多种毒力因子协同作用的，对毒力因子的深入研究将有助于探究猪链球菌的致病机理，建立快速准确的诊断鉴定方法，对疫苗的研发也有着重要意义。

猪链球菌病已给我国养猪业造成严重的经济损失，特别是高致病力的2型猪链球菌已在猪群中广泛流行并严重致病，并且具有极为重要的的公共卫生学意义。为此，本试验拟对河南省规模化猪场2型猪链球菌的毒力及毒力基因等特性进行研究，为预防和控制该病的流行提供依据。

1 材料与方法

1.1 菌株2016年1月～2016年12月分离自河南省养猪场发生呼吸困难、败血症、关节炎及神经症状的发病及死亡猪的脑、肺脏、气管、心血、关节液等的链球菌共189株，其中2型猪链球菌87株。

1.2 培养基、试剂及实验动物 TSA（Tryptic Soy Agar，胰蛋白大豆琼脂）和TSB（Tryptic Soy broth，胰蛋白大豆肉汤）购自Difco公司；绵羊全血平皿、革兰氏染色液购自郑州理利生物公司；胎牛血清自制。柱式DNA抽提试剂盒购自生工生物工程（上海）有限公司；2×TaqMix、DL2000 DNA Marker购自宝生物（大连）有限公司；小鼠购自郑州大学实验动物中心。

1.3 猪链球菌培养基配制TSB液体培养基：含TSB肉汤粉30 g，溶于1000 mL超纯水中，115℃灭菌15 min，加胎牛血清50 mL；TSA固体培养基：含TSA琼脂粉4 g，溶于100 mL超纯水中，115℃灭菌15 min，冷却至45℃加胎牛血清5 mL，倾倒平皿；于4℃保存备用。血平皿：TSA固体培养基灭菌后冷却至45℃加脱纤绵羊血5 mL。

1.4 毒力试验将分离鉴定好的2型猪链球菌接种含血清的TSB培养基，37℃ 250 r/min振摇培养24 h。用生理盐水稀释菌数约为109CFU/mL，腹腔注射小白鼠0.2 mL；同时设生理盐水阴性对照。接种后观察发病及死亡情况，剖检小白鼠，无菌取其心血分离细菌并鉴定。

1.5 引物设计猪链球菌gdh基因和2型猪链球菌cps基因引物参考文献[9]。根据猪链球菌胞外因子（epf）基因的序列设计1对引物，用于猪链球菌胞外因子（epf）基因的扩增，扩增片段大小为626 bp。epf1：5'-GCTACGACGGCCTCAGAAATC-3'，epf2：5'-TGGATCAACCACTGGTGTTAC-3'。根据猪链球菌溶菌酶释放蛋白（mrp）基因的序列设计1对引物，用于猪链球溶菌酶释放蛋白（mrp）基因的扩增，扩增片段大小为885 bp。mrp1：5'-ATCAGAATCACCACTTTTGG-3'，mrp2：5'-TCA TACCCA GTAAATACACG-3'。根据猪链球菌溶血素（sly）基因的序列设计1对引物，用于猪链球溶血素（sly）基因的扩增，扩增片段大小为1502 bp。sly1：5'-ATGAGAAAAAG TTCGCACTTGATT-3'，sly2：5'-TT GCCAGATTA CTCTATCA-3'。

1.6 毒力因子鉴定2型猪链球菌DNA提取：用接种环取纯化后对数生长期的细菌菌落放入装有50 uL纯水的ep管中，按照DNA提取试剂盒上的步骤操作，提取的DNA保存于－80℃备用。反应体系（25 μL）：2×TaqMix 12.5 μL， 10 μmol/L通用引物SS1、SS2各1 μL，模板（按照DNA提取试剂盒的操作步骤提取出的DNA）1 μL，加ddH2O 至25 μL。链球菌2型，epf基因、mrp基因、sly基因的扩增体系同猪链球菌。反应条件：95℃预变性5 min；95 ℃变性1 min，57℃退火1 min，72℃延伸30 s，共35个循环，最后72℃延伸10 min，PCR产物4℃保存。取10 uL扩增产物电泳，紫外光下观察结果。

2 结果

2.1 毒力试验所有分离鉴定的2型猪链球菌接种小鼠后，小鼠24 h内死亡。取死亡鼠心血接种绵羊全血平皿进行分离培养。结果显示，分离出的细菌与2型猪链球菌特性一致。因此，证明该分离菌为猪2型链球菌。

2.2 毒力因子鉴定用猪链球菌epf基因、mrp基因、sly基因引物扩增，结果分别扩增出626、885和1502 bp大小片段，并经序列分析发现，他们与猪链球菌SS2-1株（GenBank登录号：CP018908）基因相应片段的同源性为100%。

图1 PCR鉴定毒力因子结果Fig.1 PCR results of virulence factors

2.3 毒力因子的分布将鉴定好的87株2型猪链球菌进行mrp、sly、epf的扩增，结果共有8种基因型。基因型sly+mrp+epf+的有47株，占54.02%；sly+mrpepf+的有15株，占17.24%；sly-mrp+epf+的有7株，占8.04%；sly-mrp-epf-的有6株，占6.90%；slymrp+epf-的有5株，占5.75%；sly+mrp-epf-的有3株，占3.44%；sly+mrp+epf-的有2株，占2.29%；sly-mrpepf+的有2株，占2.29%。以上结果表明，河南省流行的2型猪链主要以毒力相对高的sly+mrp+epf+型为主，其次为sly+mrp-epf+型和sly-mrp+epf+型。

3 讨论

猪链球菌是一种重要的人畜共患病的病原，引起猪的败血症、脑膜炎、关节炎，是当今猪场最主要的细菌性疫病之一。其中猪链球菌血清型 2 型是最主要的致病性血清型。在笔者和其他的报道中均有报道，占总分离的链球菌的10%～45%不等[10-13]。本试验中2016年分离的87株2型猪链球菌占总分离链球菌的46%，因此可见，高致病力的2型猪链球菌已在猪群中广泛流行并严重致病。

猪链球菌的致病性与其毒力因子有密切关系，目前研究较多的猪链球菌主要毒力因子有荚膜多糖（capsular polysaccharide，CPS）、溶菌酶释放蛋白（muramidase-released protein，MRP）、胞外因子（extracellular protein fateror，EPF）和溶血素（suilysin，SLY）。因此本试验对分离的2型猪链球菌进行了cps、mrp、epf、sly毒力基因的检测，结果表明河南省流行的2型猪链球菌的主要以毒力相对高的sly+mrp+epf+菌株为主，这与其他的报道是一致的[14-20]。通过对猪链球菌的毒力及毒力基因进行研究，可为河南省猪链球菌病的基础研究及预防、控制与诊断提供一定的理论依据。